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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DGGE扩增问题
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wx1119

铜虫 (小有名气)

[求助] DGGE扩增问题

各位大侠，本人扩增DGGE V3区用的是B357-GC和B517，已经做了2个多月，但是一直扩增不出来片段，用不带GC夹的就能狗扩增出来！
PCR条件：95  10min
                 93   30s
                 52   45s
                 72   1min
                 30个循环
          72   5min
总基因组DNA是沼气发酵过程中的样品DNA
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1楼 2011-11-04 16:37:05
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范慧

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): 鼓励新虫应助回帖！ 2011-11-06 08:23:31
DGGE是梯度凝胶电泳
PCR是扩增
一般是先用带GC夹子的引物扩增出条带
再用扩增出来的条带做DGGE
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2楼2011-11-05 13:17:03
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陈青chenqing

铜虫 (初入文坛)
预变性的时间为什么和变性的时间不一样呢？
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自己的未来自己创造！
3楼2011-11-05 13:56:20
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wx1119

铜虫 (小有名气)
wanhscn: 交流是兴趣！ 2011-11-08 08:55:49
请给出正面的解决办法
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4楼2011-11-07 15:54:55
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！ 2011-11-08 22:12:26
引用回帖:
1楼: Originally posted by wx1119 at 2011-11-04 16:37:05:
各位大侠，本人扩增DGGE V3区用的是B357-GC和B517，已经做了2个多月，但是一直扩增不出来片段，用不带GC夹的就能狗扩增出来！
PCR条件：95  10min
                 93   30s
                 52   45s
     ...

我说几点 你可以参考参考
1  模板成分复杂，做的时候要稀释，稀释多少 梯度摸索
2  增加PCR 保护剂  BSA   吐温20  DMSO 等
3  你这个反应程序 ~~~  预变性时间太长 可能会让DNA 聚合酶失效，94°，5min 或者95°  3 到4分钟足够，退火温度应该是55吧
4  试试TD-PCR,效果挺好
总的来说 这个引物还是很经典 很好做的 呵呵 祝你好运了
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5楼2011-11-08 16:38:50
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wx1119

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 老夏853 at 2011-11-08 16:38:50:
我说几点 你可以参考参考
1  模板成分复杂，做的时候要稀释，稀释多少 梯度摸索
2  增加PCR 保护剂  BSA   吐温20  DMSO 等
3  你这个反应程序 ~~~  预变性时间太长 可能会让DNA 聚合酶失效，94°，5min 或者 ...

1、TD-PCR我也做过 但是也没p出来
2、增加PCR 保护剂  BSA ，加多少呢，这个没用过，只是酶切的时候用过，PCR没做过，50微的体系怎么加，浓度多少。
3、模板成分也稀释过，*10，*100的都弄过，可是……
哎！悲催呀！
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6楼2011-11-08 20:49:46
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yyz1001

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

LZ别着急，DGGE是需要不停地摸条件的~加油加油！
BSA我做细菌是不加的，真菌的时候加0.25。
不过我同意楼上童鞋的意见，你的预变性太长啦，5min足够啦~
话说你带GC夹PCR以后琼脂糖电泳有条带么？
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7楼2011-11-09 01:46:07
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by wx1119 at 2011-11-08 20:49:46:
1、TD-PCR我也做过 但是也没p出来
2、增加PCR 保护剂  BSA ，加多少呢，这个没用过，只是酶切的时候用过，PCR没做过，50微的体系怎么加，浓度多少。
3、模板成分也稀释过，*10，*100的都弄过，可是……
哎！ ...

把你td pcr 的反应程序还有反应体系具体成分发上来 看看
BSA 保护剂 一般是25ul 体系   20mg/ml 浓度的加0.25ul。 这个 可以做梯度摸索
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8楼2011-11-09 07:54:53
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wx1119

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wx1119 at 2011-11-08 20:49:46:
1、TD-PCR我也做过 但是也没p出来
2、增加PCR 保护剂  BSA ，加多少呢，这个没用过，只是酶切的时候用过，PCR没做过，50微的体系怎么加，浓度多少。
3、模板成分也稀释过，*10，*100的都弄过，可是……
哎！ ...

就是琼脂糖电泳的时候就没有，根本就没上DGGE的胶！
我用不带GC夹子的正常357和517跟这个一起做，就能P出来！
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9楼2011-11-09 09:14:05
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wx1119

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yyz1001 at 2011-11-09 01:46:07:
LZ别着急，DGGE是需要不停地摸条件的~加油加油！
BSA我做细菌是不加的，真菌的时候加0.25。
不过我同意楼上童鞋的意见，你的预变性太长啦，5min足够啦~
话说你带GC夹PCR以后琼脂糖电泳有条带么？

DNA  1
357-GC   0.5
517        0.5
Taq        0.5
Buffer     5
DNTP     4
体系是50的
我的DNTP的浓度是2.5nM的，Taq酶是TAKALA的，和Buffer是一套的。
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10楼2011-11-09 09:17:35
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