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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DGGE扩增问题
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wx1119

铜虫 (小有名气)

[求助] DGGE扩增问题

各位大侠，本人扩增DGGE V3区用的是B357-GC和B517，已经做了2个多月，但是一直扩增不出来片段，用不带GC夹的就能狗扩增出来！
PCR条件：95  10min
                 93   30s
                 52   45s
                 72   1min
                 30个循环
          72   5min
总基因组DNA是沼气发酵过程中的样品DNA
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1楼2011-11-04 16:37:05
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！ 2011-11-08 22:12:26
引用回帖:
1楼: Originally posted by wx1119 at 2011-11-04 16:37:05:
各位大侠，本人扩增DGGE V3区用的是B357-GC和B517，已经做了2个多月，但是一直扩增不出来片段，用不带GC夹的就能狗扩增出来！
PCR条件：95  10min
                 93   30s
                 52   45s
     ...

我说几点 你可以参考参考
1  模板成分复杂，做的时候要稀释，稀释多少 梯度摸索
2  增加PCR 保护剂  BSA   吐温20  DMSO 等
3  你这个反应程序 ~~~  预变性时间太长 可能会让DNA 聚合酶失效，94°，5min 或者95°  3 到4分钟足够，退火温度应该是55吧
4  试试TD-PCR,效果挺好
总的来说 这个引物还是很经典 很好做的 呵呵 祝你好运了
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5楼2011-11-08 16:38:50
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by wx1119 at 2011-11-08 20:49:46:
1、TD-PCR我也做过 但是也没p出来
2、增加PCR 保护剂  BSA ，加多少呢，这个没用过，只是酶切的时候用过，PCR没做过，50微的体系怎么加，浓度多少。
3、模板成分也稀释过，*10，*100的都弄过，可是……
哎！ ...

把你td pcr 的反应程序还有反应体系具体成分发上来 看看
BSA 保护剂 一般是25ul 体系   20mg/ml 浓度的加0.25ul。 这个 可以做梯度摸索
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8楼2011-11-09 07:54:53
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