应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DGGE扩增问题
111/2返回列表12下一页
查看: 1465  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wx1119

铜虫 (小有名气)

[求助] DGGE扩增问题

各位大侠，本人扩增DGGE V3区用的是B357-GC和B517，已经做了2个多月，但是一直扩增不出来片段，用不带GC夹的就能狗扩增出来！
PCR条件：95  10min
                 93   30s
                 52   45s
                 72   1min
                 30个循环
          72   5min
总基因组DNA是沼气发酵过程中的样品DNA
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-11-04 16:37:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

范慧

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): 鼓励新虫应助回帖！ 2011-11-06 08:23:31
DGGE是梯度凝胶电泳
PCR是扩增
一般是先用带GC夹子的引物扩增出条带
再用扩增出来的条带做DGGE
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-11-05 13:17:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

陈青chenqing

铜虫 (初入文坛)
预变性的时间为什么和变性的时间不一样呢？
赞一下 回复此楼
自己的未来自己创造！
3楼2011-11-05 13:56:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wx1119

铜虫 (小有名气)
wanhscn: 交流是兴趣！ 2011-11-08 08:55:49
请给出正面的解决办法
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-11-07 15:54:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！ 2011-11-08 22:12:26
引用回帖:
1楼: Originally posted by wx1119 at 2011-11-04 16:37:05:
各位大侠，本人扩增DGGE V3区用的是B357-GC和B517，已经做了2个多月，但是一直扩增不出来片段，用不带GC夹的就能狗扩增出来！
PCR条件：95  10min
                 93   30s
                 52   45s
     ...

我说几点 你可以参考参考
1  模板成分复杂，做的时候要稀释，稀释多少 梯度摸索
2  增加PCR 保护剂  BSA   吐温20  DMSO 等
3  你这个反应程序 ~~~  预变性时间太长 可能会让DNA 聚合酶失效，94°，5min 或者95°  3 到4分钟足够，退火温度应该是55吧
4  试试TD-PCR,效果挺好
总的来说 这个引物还是很经典 很好做的 呵呵 祝你好运了
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-11-08 16:38:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wx1119

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 老夏853 at 2011-11-08 16:38:50:
我说几点 你可以参考参考
1  模板成分复杂，做的时候要稀释，稀释多少 梯度摸索
2  增加PCR 保护剂  BSA   吐温20  DMSO 等
3  你这个反应程序 ~~~  预变性时间太长 可能会让DNA 聚合酶失效，94°，5min 或者 ...

1、TD-PCR我也做过 但是也没p出来
2、增加PCR 保护剂  BSA ，加多少呢，这个没用过，只是酶切的时候用过，PCR没做过，50微的体系怎么加，浓度多少。
3、模板成分也稀释过，*10，*100的都弄过，可是……
哎！悲催呀！
赞一下 回复此楼
6楼2011-11-08 20:49:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyz1001

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

LZ别着急，DGGE是需要不停地摸条件的~加油加油！
BSA我做细菌是不加的，真菌的时候加0.25。
不过我同意楼上童鞋的意见，你的预变性太长啦，5min足够啦~
话说你带GC夹PCR以后琼脂糖电泳有条带么？
赞一下 回复此楼
7楼2011-11-09 01:46:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by wx1119 at 2011-11-08 20:49:46:
1、TD-PCR我也做过 但是也没p出来
2、增加PCR 保护剂  BSA ，加多少呢，这个没用过，只是酶切的时候用过，PCR没做过，50微的体系怎么加，浓度多少。
3、模板成分也稀释过，*10，*100的都弄过，可是……
哎！ ...

把你td pcr 的反应程序还有反应体系具体成分发上来 看看
BSA 保护剂 一般是25ul 体系   20mg/ml 浓度的加0.25ul。 这个 可以做梯度摸索
赞一下 回复此楼
8楼2011-11-09 07:54:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wx1119

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wx1119 at 2011-11-08 20:49:46:
1、TD-PCR我也做过 但是也没p出来
2、增加PCR 保护剂  BSA ，加多少呢，这个没用过，只是酶切的时候用过，PCR没做过，50微的体系怎么加，浓度多少。
3、模板成分也稀释过，*10，*100的都弄过，可是……
哎！ ...

就是琼脂糖电泳的时候就没有，根本就没上DGGE的胶！
我用不带GC夹子的正常357和517跟这个一起做，就能P出来！
赞一下 回复此楼
9楼2011-11-09 09:14:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wx1119

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yyz1001 at 2011-11-09 01:46:07:
LZ别着急，DGGE是需要不停地摸条件的~加油加油！
BSA我做细菌是不加的，真菌的时候加0.25。
不过我同意楼上童鞋的意见，你的预变性太长啦，5min足够啦~
话说你带GC夹PCR以后琼脂糖电泳有条带么？

DNA  1
357-GC   0.5
517        0.5
Taq        0.5
Buffer     5
DNTP     4
体系是50的
我的DNTP的浓度是2.5nM的，Taq酶是TAKALA的，和Buffer是一套的。
赞一下 回复此楼
10楼2011-11-09 09:17:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wx1119 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 3/150 2026-09-06 13:09 by eObJPa4gWmp6
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 3/150 2026-09-06 13:09 by eObJPa4gWmp6
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 4/200 2026-09-06 12:49 by eObJPa4gWmp6
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 3/150 2026-09-06 12:49 by eObJPa4gWmp6
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 4/200 2026-09-06 12:29 by eObJPa4gWmp6
[找工作] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 7/350 2026-09-06 11:40 by eObJPa4gWmp6
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 7/350 2026-09-06 11:20 by eObJPa4gWmp6
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 8/400 2026-09-06 11:09 by eObJPa4gWmp6
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 8/400 2026-09-06 11:00 by eObJPa4gWmp6
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-04 8/400 2026-09-06 11:00 by eObJPa4gWmp6
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 7ZYIEW2YWn72 2026-09-04 9/450 2026-09-06 06:00 by E1iiBLMU2XnD
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +8 CRJ0Aq2FtVH0 2026-09-03 15/750 2026-09-06 05:48 by E1iiBLMU2XnD
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 5/250 2026-09-06 02:39 by E1iiBLMU2XnD
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 5/250 2026-09-06 02:19 by E1iiBLMU2XnD
[基金申请] 面上没中，邀请各位路过的虫友分析一下分数 +12 jackleilei 2026-09-03 13/650 2026-09-05 18:10 by fireguard
[文学芳草园] 两块石头 +6 阿美_Lml888 2026-09-03 8/400 2026-09-05 13:52 by 阿美_Lml888
[博后之家] 广西大学-广州大学招聘博士后 欢迎广大优秀人才！！！ +4 SCSIOyxguo 2026-09-03 7/350 2026-09-05 10:39 by Honglianlian
[硕博家园] Ei源刊怎么投 +4 Fengshun9711 2026-09-04 4/200 2026-09-04 19:30 by 研途知予
[硕博家园] 哈尔滨工业大学韩晓军教授课题组招收2027年硕士推免生及博士研究生 +3 灯灯灯灯DDDD 2026-09-03 3/150 2026-09-03 21:22 by 科研皮皮猪
[基金申请] 要骂人了，新模版改版就是要淡化问题凝练这种虚的东西，结果有个评委还在说凝练得不够 +9 瞬息宇宙 2026-08-31 17/850 2026-09-02 14:04 by anjeeshine
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭