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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】表达载体pCAMBIA1304表达顺序看不懂
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叮叮0504

新虫 (初入文坛)

[求助] 【求助/交流】表达载体pCAMBIA1304表达顺序看不懂

怎么有2个35S启动子啊，一个方向向左，一个方向向右，我在多克隆位点上插入了我的目的基因，报告基因GFP和GUS还会表达么，新人在线等，急啊，如果发帖不规范，版主大人大量

1304质粒图
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1楼 2011-11-03 20:11:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lixg

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！ 2011-11-09 12:19:25
引用回帖:
5楼: Originally posted by 荒寒落寞 at 2011-11-09 01:11:00:
我插入的是ORF，应该能表达，我关心的是插入在NCO和SPE之间，GFP还表达么，先不弄融合蛋白

1.先搞清楚“GFP表达”是什么意思！转录和翻译都可叫做表达。
2.是的，应该将基因插入Nco和SpeI之间。其二，必须将你的基因的ORF与GFP构建成融合蛋白，GFP才能发光。
3.否则（发生移码），即使GFP能够转录，GFP蛋白翻译不出来。故不能发光。
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6楼2011-11-09 08:32:13
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liujianmin68

木虫 (职业作家)

努力发展交叉学科

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 分析得很好！ 2011-11-06 21:53:33
载体图没什么问题。你插入外源基因不会影响gus和gfp的表达，因为这两个基因在启动子后面，没有受到外源基因的影响；但是，你插入外源基因能不能表达要看你载体构建的情况，如果你仅仅转入一个外源基因，理论上是不能表达的，如果你转入的是一个完整的表达框，可能会正常表达。
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转向地质微生物学
2楼2011-11-06 19:35:19
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zzz119

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-11-06 21:53:42
两个启动是启动表达两个不同方向的基因，不会影响GUS和GFP的表达，多克隆位点插入的基因在有操纵子的情况下会表达。。。
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3楼2011-11-06 20:50:16
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荒寒落寞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lixg at 2011-11-09 08:32:13:
1.先搞清楚“GFP表达”是什么意思！转录和翻译都可叫做表达。
2.是的，应该将基因插入Nco和SpeI之间。其二，必须将你的基因的ORF与GFP构建成融合蛋白，GFP才能发光。
3.否则（发生移码），即使GFP能够转录，GF ...

额，还是不明白啊，GFP是荧光蛋白，虽然我知道只有构建目的蛋白和GFP融合蛋白才能定位，但是如果我把目的基因插入到NCO和SPE之间，GFP和GUS还会检测到么，不会移码吧，GFP自带起始密码子ATG
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7楼2011-11-09 13:25:45
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普通回帖

荒寒落寞

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励上图 2011-11-09 12:18:29
引用回帖:
3楼: Originally posted by zzz119 at 2011-11-06 20:50:16:
两个启动是启动表达两个不同方向的基因，不会影响GUS和GFP的表达，多克隆位点插入的基因在有操纵子的情况下会表达。。。

我看有的毕业论文，插入的是多克隆位点NCOI和SPEI之间，不在MCS之间啊
还有载体的左边缘，和右边缘问题，有的载体是左边R-BORDER，这个左边是T-BORDER
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4楼2011-11-09 01:08:05
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荒寒落寞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zzz119 at 2011-11-06 20:50:16:
两个启动是启动表达两个不同方向的基因，不会影响GUS和GFP的表达，多克隆位点插入的基因在有操纵子的情况下会表达。。。

我插入的是ORF，应该能表达，我关心的是插入在NCO和SPE之间，GFP还表达么，先不弄融合蛋白
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5楼2011-11-09 01:11:00
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荒寒落寞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lixg at 2011-11-09 08:32:13:
1.先搞清楚“GFP表达”是什么意思！转录和翻译都可叫做表达。
2.是的，应该将基因插入Nco和SpeI之间。其二，必须将你的基因的ORF与GFP构建成融合蛋白，GFP才能发光。
3.否则（发生移码），即使GFP能够转录，GF ...

总之一句话，没有构建融合蛋白的情况下，GFP和GUS会翻译表达么
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8楼2011-11-09 13:29:17
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madengyu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2011-11-09 13:49:57
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lingling0629

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我现在也准备做GFP融合基因表达做蛋白的亚细胞定位，也是一位新手，我现在遇到的问题是PCAMBIA1304这个载体上的很多常用的克隆位点我基因里面都有，像XbaI、KpnI、EcoRI、speI、HindIII，我该怎么办呢？这个载体我还能用吗？如果这个载体不能用话，有哪位大哥大姐能告诉我有哪个载体我能用呢？？？感激不尽啊
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10楼2012-05-14 20:49:40
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