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sayfxxk2u

新虫 (小有名气)

[求助] 酶切的时候，条带成糊状，一片。

用fermentas的酶 进行酶切，条带成糊状，一片。小试如此，大切也是如此。
原来质粒是pET-28a的，7700bp，酶切后，HInd3，Xba1，Nde1，Sca1（单酶切位点）酶都用过，条带跑到了几百bp的位置，和未酶切的一起电泳的对比（没有存图）相距很远。如果是大切的话，就是一段糊状的条带。请问是什么原因？
酶污染了DNA酶了？还是怎么？

[ Last edited by sayfxxk2u on 2011-9-2 at 22:08 ]
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1楼 2011-09-02 22:07:13
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liukgg

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 最近很活跃啊 2011-09-03 07:44:49
sayfxxk2u(金币+1): 谢谢 2011-09-05 13:34:01
sayfxxk2u(金币+4): 2011-09-05 19:43:12
如果用了多种酶切后结果还是这样的话，酶污染的可能性不是太大，如果不放心可以换支新的酶试一下。再就是对质粒进行一下鉴定，确保是你要的质粒，根据图谱找上几个多酶切位点切一下就行。然后就是调整一下酶切条件及电泳条件，大切模糊的话可能和上样量有关，建议缩小一下上样量看看
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山水凤凰
2楼2011-09-02 23:47:54
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-03 07:44:58
sayfxxk2u(金币+1): 谢谢 2011-09-05 13:35:14
sayfxxk2u(金币+4): 2011-09-05 19:43:06
如果确定质粒本身没问题，酶也没问题的话，减少酶量缩短酶切时间试试！
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3楼2011-09-03 00:24:12
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半导体与导体

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

考虑酶的星号活性
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4楼2011-09-03 08:16:40
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 最近很活跃啊，鼓励啊 2011-09-03 12:58:34
我曾经也出现过这样的问题，但是后来发现是我提质粒的时候RNA酶的浓度加大了，导致酶切后成片状了。
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5楼2011-09-03 09:35:23
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sayfxxk2u

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liukgg at 2011-09-02 23:47:54:
如果用了多种酶切后结果还是这样的话，酶污染的可能性不是太大，如果不放心可以换支新的酶试一下。再就是对质粒进行一下鉴定，确保是你要的质粒，根据图谱找上几个多酶切位点切一下就行。然后就是调整一下酶切条件 ...

我没有减少上样量，就是减少了下时间。。就没有糊。酶量也减少。
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6楼2011-09-05 13:34:55
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sayfxxk2u

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yguang at 2011-09-03 00:24:12:
如果确定质粒本身没问题，酶也没问题的话，减少酶量缩短酶切时间试试！

我没有减少上样量，就是减少了下酶切时间，从3个小时减少到半个小时。。酶量减少了10u，条带是一条，没有糊，但是没有做酶切3个小时时候的对照（不知道这个切3个小时会不会糊），因为换了相同质粒的不同管。
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7楼2011-09-05 13:37:29
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-05 18:43:44
可能原因是产生星活性了，至于星活性是如何产生的可能原因有以下几点:
1.酶的Buffer不对
2.酶浓度太高，即酶用量太大
3.质粒Buffer浓度不对
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8楼2011-09-05 15:24:31
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