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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr加样顺序
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新虫 (正式写手)

[交流] pcr加样顺序 已有2人参与

鄙人用的是：无菌水--buffer---Mg离子---模板--上游引物 - 下游引物--dNTP--Taq酶。
不知道有没有最优的加样顺序？

另外：操作时要在冰上么？为什么呢？
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1楼 2011-08-19 10:54:26
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+3): good 2011-08-19 12:02:40
西瓜(金币+2, MolEPI+1): 补上！ 2011-08-19 18:40:52
那就是把除了引物，模板以外的所有一样的东西先混好，然后分装再加模板和引物。或者直接购买PCR MIX.
PCR一般很粗犷的，没什么问题，分开加的话，酶放最后就好了。
在冰上操作是为了冻结酶的活性，防止产生非特性的扩增。当然一般分子生物学操作均最好在冰上操作，比如万一混入什么核酸酶呀什么的，蛋白酶什么的，冰上也没什么活性，一加热就又都失活了。
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2楼2011-08-19 11:03:18
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新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by roomofxw at 2011-08-19 11:03:18:
那就是把除了引物，模板以外的所有一样的东西先混好，然后分装再加模板和引物。或者直接购买PCR MIX.
PCR一般很粗犷的，没什么问题，分开加的话，酶放最后就好了。
在冰上操作是为了冻结酶的活性，防止产生非特 ...

厉害！精辟！
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3楼2011-08-19 11:12:38
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wzqno

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(金币+1): 预混最好 2011-08-19 15:51:35
西瓜(金币+2): good 2011-08-19 18:41:12
最好最后一步加模板，防止模板污染很重要，其他的顺序一般是先加体积大的，再加体积小的，taq酶倒数第二个加，要是做得组数比较多，可以把体积合并，到加模板的时候再分开。
同时需要做阳性对照和阴性对照，这也是必须的
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4楼2011-08-19 15:37:04
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256k

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wzqno at 2011-08-19 15:37:04:
最好最后一步加模板，防止模板污染很重要，其他的顺序一般是先加体积大的，再加体积小的，taq酶倒数第二个加，要是做得组数比较多，可以把体积合并，到加模板的时候再分开。
同时需要做阳性对照和阴性对照，这也 ...

谢谢指教
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5楼2011-08-19 15:43:09
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