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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 合成基因没有检测到酶活？？？
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794378428

银虫 (小有名气)

[求助] 合成基因没有检测到酶活？？？

公司合成了一个质粒，在大肠杆菌BL21中表达，经IPTG诱导后，离心得到菌体，破碎细胞，纯化，经过SDS-PAGE能看到目的蛋白的条带，但是没有检测到酶活。不知道大家有没有遇到过这种情况，是哪个环节上可能出现了问题呢，困惑很久了，请大家提提建议
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1楼2011-07-03 21:28:45
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794378428

银虫 (小有名气)
dddddddd
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2楼2011-07-03 21:29:58
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gwbk

木虫 (正式写手)

我也合成了几条基因，￥3，生工，好贵啊，希望不会出现你这种情况。
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3楼2011-07-03 22:24:04
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794378428

银虫 (小有名气)
对啊，我那个花了快3000大洋，不知道是什么情况，纠结中
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4楼2011-07-04 11:12:34
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jiangyhai

金虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-07-04 18:02:20
原核表达的蛋白很多是不具有活性的。不知道你的蛋白是可溶还是包涵体表达？如果是包涵体的话肯定是没有活性的。
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静心做事。
5楼2011-07-04 11:40:18
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794378428

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jiangyhai at 2011-07-04 11:40:18:
原核表达的蛋白很多是不具有活性的。不知道你的蛋白是可溶还是包涵体表达？如果是包涵体的话肯定是没有活性的。

不是包涵体
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6楼2011-07-04 12:42:45
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794378428

银虫 (小有名气)
ddddddddddd
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7楼2011-07-04 14:40:02
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-07-04 18:02:31
794378428(金币+2): 2011-07-05 08:21:44
以前看同学做蛋白表达，经常出现这种问题。
你确信构建的质粒上插入的基因片段与原始基因序列相比，没有出现碱基突变或缺失、插入的情况吗？
如果在基因层面上没有错误的话，应该就是测酶活环节出现了问题。有些蛋白表达需要加入一些特殊的金属离子，这个你要仔细查一下。之前我有个同学测了半年的酶活都没有结果，最后往里面加了种离子就可以了。
看一下这个酶的底物，有没有什么特殊性。
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8楼2011-07-04 17:01:22
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794378428

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 足下客 at 2011-07-04 17:01:22:
以前看同学做蛋白表达，经常出现这种问题。
你确信构建的质粒上插入的基因片段与原始基因序列相比，没有出现碱基突变或缺失、插入的情况吗？
如果在基因层面上没有错误的话，应该就是测酶活环节出现了问题。有些 ...

质粒是老板设计的，这个我不清楚。呵呵，金属离子、ph、底物浓度等条件我都是参考一篇最近外文文献上的做法，都考虑到了。现在不知道问题到底出在哪里呢？
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9楼2011-07-05 08:23:59
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libra1982

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

794378428(金币+1): 2011-07-05 10:34:04
794378428(金币+1): 2011-07-06 10:26:20
794378428(金币+1): 2011-07-06 13:19:52
引用回帖:
Originally posted by 794378428 at 2011-07-05 08:23:59:
质粒是老板设计的，这个我不清楚。呵呵，金属离子、ph、底物浓度等条件我都是参考一篇最近外文文献上的做法，都考虑到了。现在不知道问题到底出在哪里呢？

老板设计的啊？你们老板倒是很亲力亲为。这个最好先看下基因，包括接头等地方有没有错误，不然都白折腾了。
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10楼2011-07-05 10:31:12
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