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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR没有结果
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qyqy512

铜虫 (初入文坛)

[求助] PCR没有结果

本人要做构建表达载体，可是目的条带p不出来，引物是根据NCBI上已经公布的序列设计的编码区，说明引物应该是没问题的；模板可以p出其它基因，唯独目的基因p不出来，温度梯度40-70℃都试过了，模板梯度也试过了，都出不来，只有一次在57℃时出来了非常淡的条带，50ul体系电泳就跟平时5ul电泳结果差不多，割胶回收之后连接没成功，之后再怎么也p不出来了。请高手指教！！！很急啊！！！
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1楼 2011-05-25 19:36:45
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-05-25 19:54:06
qyqy512(金币+1): hsp基因，2000bp，引物是老师给设计的，自己也不知道，pcr体系是酶0.8ul、引物各1ul、dntp4ul、buffer5ul、模板1ul，总共50ul体系。用得是艾德莱的taq，艾德莱的高保真酶也用过，也p不出来 2011-05-26 08:22:21
建议以后问问题要专业一点，像您这样只简单描述一下的话，没有办法得到有质量的回复
最好有图、数据
哪个基因，扩多少bp？引物序列？pcr体系？什么酶？
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2楼2011-05-25 19:52:36
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

模板能P出来说明引物没问题，把构建好的载体提质粒酶切验证一下，看有没有构建成功，等验证完再说
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-05-25 20:13:15
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1.PCR本来就是一个变数很大的反应，首先你的质粒载体构建好了么？检查好了确保目的基因的正确性
2.按理说能你能P出浅带来，引物应该没问题，要不再检查一下，看看参数什么的，这样也好定你的温度梯度
3.循环数适当调整一下，有的时候就是因为循环数少而P不出来
4.还有就是你目的条带的碱基数，有的时候太长了也不好P的
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4楼2011-05-25 20:47:17
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chachaxionga

新虫 (正式写手)
我也想问同样的问题，最近在做RT和gene walking，这个基因根据NCBI上的序列设计引物，RT扩增出来过一次，测序有突变，有多个终止子出现，因为后面要对蛋白表达进行亚细胞定位，所以要想再再，但是之后就再也没有扩出来过，换过最近推荐比较好用的酶，同时换过引物之后，RT扩出800多的片段，本来是应该2900多，还是往下游做了一下，测序跟公布的cDNA 比对，这个前后完全匹配，就是中间完全缺失了2000多，望高人指点。
基因组长距离扩增，想先拿到一部分序列，再做walking，一步一步拿到完整的基因组序列，长距离扩增时，拿到一部分序列，约3000bp，但是之后walking一直没有结果，只是在点样孔出有东西，刚开始怀疑模板量多了，之后减少了模板量，但还是没有结果
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5楼2011-06-07 16:24:21
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)
做PCR变数确实是太大，这个时候要停下来，想一想，然后是稍做调整。模板，引物，反应体系，温度，循环，都有可能，有时候要做做对照。PCR，我做过不少，但总结不多，希望有更强的人给你回答。
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6楼2011-06-07 16:51:41
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