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qyqy512

铜虫 (初入文坛)

[求助] PCR没有结果

本人要做构建表达载体,可是目的条带p不出来,引物是根据NCBI上已经公布的序列设计的编码区,说明引物应该是没问题的;模板可以p出其它基因,唯独目的基因p不出来,温度梯度40-70℃都试过了,模板梯度也试过了,都出不来,只有一次在57℃时出来了非常淡的条带,50ul体系电泳就跟平时5ul电泳结果差不多,割胶回收之后连接没成功,之后再怎么也p不出来了。请高手指教!!!很急啊!!!
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)

做PCR变数确实是太大,这个时候要停下来,想一想,然后是稍做调整。模板,引物,反应体系,温度,循环,都有可能,有时候要做做对照。PCR,我做过不少,但总结不多,希望有更强的人给你回答。
6楼2011-06-07 16:51:41
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-05-25 19:54:06
qyqy512(金币+1): hsp基因,2000bp,引物是老师给设计的,自己也不知道,pcr体系是酶0.8ul、引物各1ul、dntp4ul、buffer5ul、模板1ul,总共50ul体系。用得是艾德莱的taq,艾德莱的高保真酶也用过,也p不出来 2011-05-26 08:22:21
建议以后问问题要专业一点,像您这样只简单描述一下的话,没有办法得到有质量的回复
最好有图、数据
哪个基因,扩多少bp?引物序列?pcr体系?什么酶?
2楼2011-05-25 19:52:36
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

模板能P出来说明引物没问题,把构建好的载体提质粒酶切验证一下,看有没有构建成功,等验证完再说
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-05-25 20:13:15
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1.PCR本来就是一个变数很大的反应,首先你的质粒载体构建好了么?检查好了确保目的基因的正确性
2.按理说能你能P出浅带来,引物应该没问题,要不再检查一下,看看参数什么的,这样也好定你的温度梯度
3.循环数适当调整一下,有的时候就是因为循环数少而P不出来
4.还有就是你目的条带的碱基数,有的时候太长了也不好P的
4楼2011-05-25 20:47:17
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