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生命核心

木虫 (正式写手)

[求助] pcr产物问题请教大家

梯度PCR，50-60退火。其他条件常规，每个温度都有得到产物，设定的产物大小70bp，据marker判断为40-60之间，引物20bp左右，应该不是二聚体，胶浓度3%。多次做结果基本一致，比较疑惑，请教大家！谢谢了！
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1楼 2011-05-23 16:19:20
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 有道理 2011-05-23 18:31:39
引用回帖:
Originally posted by 生命核心 at 2011-05-23 16:19:20:
梯度PCR，50-60退火。其他条件常规，每个温度都有得到产物，设定的产物大小70bp，据marker判断为40-60之间，引物20bp左右，应该不是二聚体，胶浓度3%。多次做结果基本一致，比较疑惑，请教大家！谢谢了！

疑惑什么？
如果怕二聚体的话做个空白对照：只加引物。
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2楼2011-05-23 17:05:06
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nininini

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我的也是同样，只加引物对照显示其实就是引物二聚体，如果产物量高的话，小条带基本就没有了，不影响结果的吧
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3楼2011-05-23 18:57:12
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生命核心

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2011-05-23 17:05:06:
疑惑什么？
如果怕二聚体的话做个空白对照：只加引物。

谢谢指导 空白对照做了 不是的 目前就只有分子量感觉差10-20bp对不上 这个原因是什么呢 谢谢
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4楼2011-05-23 20:34:12
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生命核心

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-05-23 18:57:12:
我的也是同样，只加引物对照显示其实就是引物二聚体，如果产物量高的话，小条带基本就没有了，不影响结果的吧

谢谢建议 作的片断分子量较小 还不是二聚体 就是分子量差10-20bp对不上 这个原因不明
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5楼2011-05-23 20:36:13
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

生命核心(金币+3): 好的 非常感谢 准备PAGE胶 2011-05-24 09:18:44
引用回帖:
Originally posted by 生命核心 at 2011-05-23 20:34:12:
谢谢指导 空白对照做了 不是的 目前就只有分子量感觉差10-20bp对不上 这个原因是什么呢 谢谢

从你的描述中感觉不确定是否缺失了碱基对吧？
1.你用的Marker是100bp最小单位？换更小的Marker精确定下分子量。
2.做个TA克隆测序。
3.不爽的话跑PAGE胶。
4.结合你下一步实验，假设目前P的产物正确，继续实验。因为确定P出了大小差不多的东西，而且很干净。除了模板有问题，基本不会因为PCR过程导致的缺失。所以在实验代价可以承受范围内，可以选择继续实验。
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6楼2011-05-23 22:03:45
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