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生命核心

木虫 (正式写手)

[求助] pcr产物问题请教大家

梯度PCR,50-60退火。其他条件常规,每个温度都有得到产物,设定的产物大小70bp,据marker判断为40-60之间,引物20bp左右,应该不是二聚体,胶浓度3%。多次做结果基本一致,比较疑惑,请教大家!谢谢了!
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 有道理 2011-05-23 18:31:39
引用回帖:
Originally posted by 生命核心 at 2011-05-23 16:19:20:
梯度PCR,50-60退火。其他条件常规,每个温度都有得到产物,设定的产物大小70bp,据marker判断为40-60之间,引物20bp左右,应该不是二聚体,胶浓度3%。多次做结果基本一致,比较疑惑,请教大家!谢谢了!

疑惑什么?
如果怕二聚体的话做个空白对照:只加引物。
2楼2011-05-23 17:05:06
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nininini

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我的也是同样,只加引物对照显示其实就是引物二聚体,如果产物量高的话,小条带基本就没有了,不影响结果的吧
3楼2011-05-23 18:57:12
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生命核心

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by adslye at 2011-05-23 17:05:06:
疑惑什么?
如果怕二聚体的话做个空白对照:只加引物。

谢谢指导 空白对照做了 不是的 目前就只有分子量感觉差10-20bp对不上 这个原因是什么呢 谢谢
4楼2011-05-23 20:34:12
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生命核心

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-05-23 18:57:12:
我的也是同样,只加引物对照显示其实就是引物二聚体,如果产物量高的话,小条带基本就没有了,不影响结果的吧

谢谢建议 作的片断分子量较小 还不是二聚体 就是分子量差10-20bp对不上 这个原因不明
5楼2011-05-23 20:36:13
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

生命核心(金币+3): 好的 非常感谢 准备PAGE胶 2011-05-24 09:18:44
引用回帖:
Originally posted by 生命核心 at 2011-05-23 20:34:12:
谢谢指导 空白对照做了 不是的 目前就只有分子量感觉差10-20bp对不上 这个原因是什么呢 谢谢

从你的描述中感觉不确定是否缺失了碱基对吧?
1.你用的Marker是100bp最小单位?换更小的Marker精确定下分子量。
2.做个TA克隆测序。
3.不爽的话跑PAGE胶
4.结合你下一步实验,假设目前P的产物正确,继续实验。因为确定P出了大小差不多的东西,而且很干净。除了模板有问题,基本不会因为PCR过程导致的缺失。所以在实验代价可以承受范围内,可以选择继续实验。
6楼2011-05-23 22:03:45
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