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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 原核表达WB 多条带
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wyhwawj_87

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助 原核表达WB 多条带 已有5人参与

我用的是PET-28，在BL21中的表达，IPTG 0.5mM 诱导4h，菌体制样SDS-PAGE和WB,page胶考染没有差异条带，WB检测时却有多条带，并且比预计大（20kd》10kd） 我换过载体和表达菌株都出现了这个问题！！请问大侠们是什么问题啊？？！！！

  自己分析：我的片段含有多对二硫键，80个aa中含有24个CYS ,是否可能是二硫键太多形成了多聚体，多聚体之间又因为二硫键的断裂而形成大小不一的单体？？？
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好想好想啊 ~~~
1楼 2011-05-03 14:36:04
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(金币+1): 可以详细一点 2011-05-03 16:14:47
加1mmol的DTT再做看看
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2楼2011-05-03 14:48:18
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(金币+2): 很有建设性 2011-05-03 16:15:45
除了多聚体的原因，你的一抗是否特异性很强，你收否做了空菌裂解液的WB？
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3楼2011-05-03 15:12:41
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qjy_134

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(金币+2): 有理 2011-05-03 21:06:45
要不就是实验没做好，最大是你的抗体不好用，楼主的抗体是自己做的嘛？
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4楼2011-05-03 20:48:25
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lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)

小堂
★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+4): 鼓励交流 2011-05-04 00:48:23
你确定你的载体，你的序列没问题吗？
你的载体上没有连接了除了你的目的基因外的其他片段吗？
我们实验室曾出过这样的问题，自己的载体上海连接了其他的片段，结果表达出来的东西肯定是要大的啊，这种细节的东西千万不能忽略~~
基因上没问题，再来考虑表达和操作的问题
你的抗体是单克隆抗体吗？
赞一下(2人) 回复此楼
坚持能无数次改变人生的风景，因为只要路是对的，就不怕远~~~
5楼2011-05-03 23:19:50
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gppwfh

金虫 (正式写手)
我同意2楼得
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6楼2011-05-04 10:57:20
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wyhwawj_87

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by elvias at 2011-05-03 15:12:41:
除了多聚体的原因，你的一抗是否特异性很强，你收否做了空菌裂解液的WB？

我做了PET-28空载转化BL21的WB,没有条带啊
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好想好想啊 ~~~
7楼2011-05-05 11:21:57
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wyhwawj_87

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lstt09nk at 2011-05-03 23:19:50:
你确定你的载体，你的序列没问题吗？
你的载体上没有连接了除了你的目的基因外的其他片段吗？
我们实验室曾出过这样的问题，自己的载体上海连接了其他的片段，结果表达出来的东西肯定是要大的啊，这种细节的东西 ...

我用的是HIS的鼠单抗，表达载体测序显示正确的~~~
赞一下 回复此楼
好想好想啊 ~~~
8楼2011-05-05 11:23:05
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wyhwawj_87

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by qjy_134 at 2011-05-03 20:48:25:
要不就是实验没做好，最大是你的抗体不好用，楼主的抗体是自己做的嘛？

重复了好几次都这样 抗体是HIS鼠单抗~~
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好想好想啊 ~~~
9楼2011-05-05 11:24:08
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wyhwawj_87

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): 很好学！鼓励哦！ 2011-05-05 12:38:48
引用回帖:
Originally posted by xuguanghai at 2011-05-03 14:48:18:
加1mmol的DTT再做看看

我做蛋白制样的时候一般都是100度加热10min，然后还加了B-巯基乙醇,你觉得DTT 效果会好很多吗？？
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好想好想啊 ~~~
10楼2011-05-05 11:27:07
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