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wyhwawj_87

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助 原核表达WB 多条带 已有5人参与

我用的是PET-28,在BL21中的表达,IPTG 0.5mM 诱导4h,菌体制样SDS-PAGE和WB,page胶考染没有差异条带,WB检测时却有多条带,并且比预计大(20kd》10kd) 我换过载体和表达菌株都出现了这个问题!!请问大侠们是什么问题啊??!!!

  自己分析:我的片段含有多对二硫键,80个aa中含有24个CYS ,是否可能是二硫键太多形成了多聚体,多聚体之间又因为二硫键的断裂而形成大小不一的单体???
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好想好想啊 ~~~
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qjy_134

铜虫 (小有名气)


★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 有理 2011-05-03 21:06:45
要不就是实验没做好,最大是你的抗体不好用,楼主的抗体是自己做的嘛?
4楼2011-05-03 20:48:25
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xuguanghai

木虫 (职业作家)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
1949stone(金币+1): 可以详细一点 2011-05-03 16:14:47
加1mmol的DTT再做看看
2楼2011-05-03 14:48:18
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 很有建设性 2011-05-03 16:15:45
除了多聚体的原因,你的一抗是否特异性很强,你收否做了空菌裂解液的WB?
3楼2011-05-03 15:12:41
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lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)

小堂

★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+4): 鼓励交流 2011-05-04 00:48:23
你确定你的载体,你的序列没问题吗?
你的载体上没有连接了除了你的目的基因外的其他片段吗?
我们实验室曾出过这样的问题,自己的载体上海连接了其他的片段,结果表达出来的东西肯定是要大的啊,这种细节的东西千万不能忽略~~
基因上没问题,再来考虑表达和操作的问题
你的抗体是单克隆抗体吗?
坚持能无数次改变人生的风景,因为只要路是对的,就不怕远~~~
5楼2011-05-03 23:19:50
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