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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 【求助/交流】蛋白样品加热煮过和不煮，SDS-PAGE结果差异显著，这是为何？
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kerry2011

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】蛋白样品加热煮过和不煮，SDS-PAGE结果差异显著，这是为何？

我从一株细菌中筛选蛋白酶，发酵液测出了不错的蛋白酶活，但是发酵液超滤浓缩以后，样品加热煮过之后SDS-PAGE只在30K左右有一条带，不加热直接上样，SDS-PAGE在45-70K Da之间有多条带，这是为何？
发酵液通过55%的硫酸盐沉淀，重溶，透析，再跑SDS-PAGE，煮过的样品弥散，几乎没有主带，不煮的样品有多条带，这是为何？
请虫友们指教。
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1楼 2011-04-06 09:34:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
kerry2011(金币+1):谢谢参与
wolfebst(金币+1): 谢谢参与 2011-04-13 14:28:27
加热煮沸有助于蛋白的二硫键打开
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4楼2011-04-06 14:23:07
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普通回帖

goldfox1981

木虫 (著名写手)
★ ★
kerry2011(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1): 鼓励交流~~~ 2011-04-06 18:04:17
是不是加热煮沸有助于蛋白的二硫键打开啊，长链断裂呈短的多肽链
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2楼2011-04-06 09:47:17
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郝钊

金虫 (小有名气)
★
kerry2011(金币+1):谢谢参与
不懂，学习一下……
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3楼2011-04-06 11:23:10
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802311820

金虫 (小有名气)
★
kerry2011(金币+1):谢谢参与
不懂，帮顶
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5楼2011-04-07 09:56:26
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jjlbest

木虫 (著名写手)
★ ★
kerry2011(金币+1):谢谢参与
wolfebst(金币+1): 谢谢参与 2011-04-13 14:28:55
加热煮的话，一般是破坏蛋白的空间结构，蛋白都是线性的，按照蛋白的分子量大小不同来分离，而没有煮的话，蛋白的空间结构依然完好，所以跑得快慢就不止和分子量有关了，还和它的空间结构有关，所以SDS-PAGE电泳结果差异显著也就不足为奇了。
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6楼2011-04-08 19:37:37
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wazlf

银虫 (正式写手)
★ ★
kerry2011(金币+1):谢谢参与
wolfebst(金币+1): 谢谢参与 2011-04-13 14:29:40
加热煮的话，蛋白质的空间结够被破坏了，就是变性，属于不可能复性的变性，如果煮的时间长，就可能导致蛋白质的一级结构破坏，形成分子量不同的蛋白，甚至多肽，就是出现了你说的很多条带。
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7楼2011-04-13 10:51:17
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30937747

木虫 (小有名气)

..

★ ★
kerry2011(金币+1):谢谢参与
wolfebst(金币+1): 谢谢参与 2011-04-13 14:30:07
加热煮沸就是为了破坏蛋白质的高级结构.煮过的蛋白跑胶就不会受到它本身高级结构的影响,只和大小相关.不煮的话,跑胶的速率就与很多其他因素相关,特别是高级结构.
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8楼2011-04-13 14:26:57
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kerry2011

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-04-13 10:51:17:
加热煮的话，蛋白质的空间结够被破坏了，就是变性，属于不可能复性的变性，如果煮的时间长，就可能导致蛋白质的一级结构破坏，形成分子量不同的蛋白，甚至多肽，就是出现了你说的很多条带。

可是有的时候，煮过后SDS-PAGE上没有任何条带了，不煮就有条带？
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9楼2011-04-14 15:35:43
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我要飞ddd

新虫 (初入文坛)
★
kerry2011(金币+1):谢谢参与
我这胶都不凝，无语了
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10楼2011-08-21 10:58:09
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★
kerry2011(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
10楼: Originally posted by 我要飞ddd at 2011-08-21 10:58:09:
我这胶都不凝，无语了

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11楼2011-08-21 20:50:20
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梓魅

铜虫 (正式写手)
★
kerry2011(金币+1):谢谢参与
染不上色的话，可能也与灵敏度有关吧
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12楼2011-12-08 11:49:15
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296595127

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
煮过的蛋白和未煮过的蛋白测蛋白质浓度会有区别吗？希望虫友指教
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13楼2012-04-26 22:38:32
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清风散人

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1204134楼: Originally posted by 我要飞ddd at 2011-08-21 10:58:09
我这胶都不凝，无语了

我的样品第二次煮沸后第二次跑效果居然更好，怎么回事呢
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14楼2012-08-04 20:38:13
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robert-RBT

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
加热主要是使蛋白质空间结构破坏，减小影响电泳迁移率的因素。你检测的是蛋白酶，样品最好加蛋白酶抑制剂后再处理。煮的时候，不能超过98度，5分钟。等温度达到以后迅速放入样品，不能在温度没到的时候放入样品等待升温。有的蛋白酶是能自我降解的。
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15楼2012-08-04 20:57:17
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conanzzz

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
741285楼: Originally posted by kerry2011 at 2011-04-14 15:35:43
可是有的时候，煮过后SDS-PAGE上没有任何条带了，不煮就有条带？...

我也发现煮过后居然什么条带都没有了,这是为什么呢
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16楼2012-12-14 10:48:41
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鲍鲍田园

新虫 (初入文坛)
不懂， 学习了
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17楼2013-04-22 15:20:04
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chlorella409

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
加热肯定会破坏蛋白质的结构，如果你的样品中没有明显影响蛋白跑胶结果的东西就不用加热了，普通SDS-PAGE是变性胶，里面的SDS会破坏蛋白，你可以试试非变性胶能跑出你真正的蛋白大小
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18楼2013-04-22 17:08:22
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小小米呐

新虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
18楼: Originally posted by chlorella409 at 2013-04-22 17:08:22
加热肯定会破坏蛋白质的结构，如果你的样品中没有明显影响蛋白跑胶结果的东西就不用加热了，普通SDS-PAGE是变性胶，里面的SDS会破坏蛋白，你可以试试非变性胶能跑出你真正的蛋白大小

请问下，今天跑出来的胶Marker没显示出来，朋友说可以尝试胶样品加热，可以吗？
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19楼2013-07-03 20:27:14
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chlorella409

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by 小小米呐 at 2013-07-03 20:27:14
请问下，今天跑出来的胶Marker没显示出来，朋友说可以尝试胶样品加热，可以吗？...

你的胶Marker没显示的话你是不是换下marker试试，加热胶样品一般只有在做细胞沉淀或者有尿素时采用
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20楼2013-07-04 08:41:16
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青蛙良

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，你的问题解决了没？
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21楼2015-03-10 09:56:50
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