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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】镍柱纯化
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tanlianren

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】镍柱纯化

求助各位大侠，目前做到重组蛋白的镍柱纯化，蛋白相对较大，70kd，分泌型的，纯化前，检验上清是有目的蛋白的，过镍柱后，用 50，100，150，200，250mM的咪唑洗脱，分别进行western blot后，均无条带，请问除了继续改变咪唑的洗脱梯度外，我还需要改变什么条件，还是换其他的纯化方法。
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1楼 2011-03-22 19:52:55
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laoshu16

银虫 (小有名气)
你上柱上上去没，洗杂洗掉了没，蛋白要是还挂在柱子上就加大咪唑浓度呗，你看你的柱子最大耐受多大浓度的咪唑，还有你的各个buffer里面没有还原剂吧
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2楼2011-03-25 13:54:35
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toxicpeach

木虫 (正式写手)
提醒你注意溶液和样品中不能含有EDTA，DTT和b-巯基乙醇等还原剂也要控制浓度，要根据你的Ni2+柱的耐受性来确定，并且各个步骤都要收集样品进行电泳检测才能进分析问题出在哪里，纯化的样品和溶液均要用0.45um过滤，如果你的样品含有较多的 组氨酸，需要加大咪唑浓度，最大可以到达500mM，用最大浓度的咪唑洗脱后，还应该用NaOH清洗，看看是否是因为蛋白质沉淀了不能洗脱。由于你的蛋白和纯化溶液没有具体写出来，所以不好帮助你分析。
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3楼2011-03-25 14:05:34
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