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tanlianren

银虫 (初入文坛)


[交流] 【求助/交流】镍柱纯化

求助各位大侠,目前做到重组蛋白的镍柱纯化,蛋白相对较大,70kd,分泌型的,纯化前,检验上清是有目的蛋白的,过镍柱后,用 50,100,150,200,250mM的咪唑洗脱,分别进行western blot后,均无条带,请问除了继续改变咪唑的洗脱梯度外,我还需要改变什么条件,还是换其他的纯化方法。
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laoshu16

银虫 (小有名气)


你上柱上上去没,洗杂洗掉了没,蛋白要是还挂在柱子上就加大咪唑浓度呗,你看你的柱子最大耐受多大浓度的咪唑,还有你的各个buffer里面没有还原剂吧
2楼2011-03-25 13:54:35
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toxicpeach

木虫 (正式写手)


提醒你注意溶液和样品中不能含有EDTA,DTT和b-巯基乙醇等还原剂也要控制浓度,要根据你的Ni2+柱的耐受性来确定,并且各个步骤都要收集样品进行电泳检测才能进分析问题出在哪里,纯化的样品和溶液均要用0.45um过滤,如果你的样品含有较多的 组氨酸,需要加大咪唑浓度,最大可以到达500mM,用最大浓度的咪唑洗脱后,还应该用NaOH清洗,看看是否是因为蛋白质沉淀了不能洗脱。由于你的蛋白和纯化溶液没有具体写出来,所以不好帮助你分析。
3楼2011-03-25 14:05:34
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