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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】western 曝光actin正常，但是样品却曝不出来
汕头大学海洋科学接受调剂
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huangwensh

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】western 曝光actin正常，但是样品却曝不出来

western 曝光actin正常，但是样品却曝不出来，样品整张膜都发光，我试过一抗的浓度从1:500到1:3000都是这种情况，封闭时间最长的时候封闭过夜，却还是整张膜都发光（一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分钟），请问各位是哪里出的问题
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1楼 2011-01-06 21:30:41
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feng__

金虫 (著名写手)
★
huangwensh(金币+1): 2011-01-07 10:19:19
最爱花诗雨(金币+1):good 2011-01-07 10:23:09
是不是样品有问题，或者样品处理过程中有问题

再就是抗体了

一抗我们做一般都是1；400

二抗1；4000
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2楼2011-01-07 10:05:27
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:05:27:
是不是样品有问题，或者样品处理过程中有问题

再就是抗体了

一抗我们做一般都是1；400

二抗1；4000

那我的actin曝出来都很正常，样品是不是不该有问题啊？
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3楼2011-01-07 10:18:59
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feng__

金虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2):good 2011-01-07 16:40:31
huangwensh(金币+3): 2011-01-07 16:58:42
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-07 10:18:59:



那我的actin曝出来都很正常，样品是不是不该有问题啊？

恩，考虑下抗体的问题，再多做几次，有的时候是这样的，当时我跟同学在一块胶上跑样品，我的结果就很好，他的就出不来，后来再做就又出来了，也不知道到底是哪里出问题了，还有，你的样品是什么啊？细胞表达的蛋白吗？如果是的话，分清楚是胞外表达还是胞内，核内，如果是后者，那actin表达，你的样品不表达也是正常的，要破碎细胞壁，细胞核！呵呵，自己的一点小经验
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4楼2011-01-07 10:38:07
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:38:07:


恩，考虑下抗体的问题，再多做几次，有的时候是这样的，当时我跟同学在一块胶上跑样品，我的结果就很好，他的就出不来，后来再做就又出来了，也不知道到底是哪里出问题了，还有，你的样品是什么啊？细胞表达的 ...

我做的是总蛋白，我都做了一个多月了，每次都是这样，都是一整张膜都在发光，不管我用多大浓度的一抗和二抗洗多长时间，封闭多长时间，哎
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5楼2011-01-07 16:59:56
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feng__

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-07 16:59:56:


我做的是总蛋白，我都做了一个多月了，每次都是这样，都是一整张膜都在发光，不管我用多大浓度的一抗和二抗洗多长时间，封闭多长时间，哎

整张膜发亮还真没遇见过#35
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6楼2011-01-07 18:09:31
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-06 21:30:41:
western 曝光actin正常，但是样品却曝不出来，样品整张膜都发光，我试过一抗的浓度从1:500到1:3000都是这种情况，封闭时间最长的时候封闭过夜，却还是整张膜都发光（一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分钟），请问各位 ...

你是怎么做一抗从1：500到1：3000的呢?是不是要做很多张膜啊？

每张膜上有几个样品呢?

请指教
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7楼2011-01-10 08:52:03
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zx1984

木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2011-01-10 09:04:52
huangwensh(金币+1): 2011-01-10 11:01:00
可能二抗有问题，这种情况我也有过，重新买二抗试试。
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8楼2011-01-10 08:57:36
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
增加一抗浓度1:20       1:50     1：100
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9楼2011-01-10 09:14:30
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
有可能是封闭液的问题
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10楼2011-01-10 09:16:12
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zx1984 at 2011-01-10 08:57:36:
可能二抗有问题，这种情况我也有过，重新买二抗试试。

二抗我们实验室大家都用一样的，其他同学都没出现问题呀，二抗的浓度，我也试了好几个效果都是一样的呢，
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11楼2011-01-10 11:02:16
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by xuqingchun33 at 2011-01-10 09:14:30:
增加一抗浓度1:20       1:50     1：100

不好意思金币发完了，这会不会太大了啊，说明书上推荐的一抗浓度最大是1:300
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12楼2011-01-10 11:03:54
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by xuqingchun33 at 2011-01-10 09:16:12:
有可能是封闭液的问题

不好意思金币发完了，我用的是脱脂奶粉5%的，我们实验室其他人都用这个没有这个问题，封闭时间我也从1小时试到过夜封闭效果都一样的呢
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13楼2011-01-10 11:05:23
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-10 08:52:03:



你是怎么做一抗从1：500到1：3000的呢?是不是要做很多张膜啊？

每张膜上有几个样品呢?

请指教

是的我做了好多次，这些浓度都试过了，每张膜上刚开始是8个样，后来条件老不对，我怕浪费样品就每张膜上上了四个样了，
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14楼2011-01-10 11:09:41
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2011-01-12 07:55:37
一，蛋白的丰度够不够
二，确保一抗没问题
三，蛋白大小，这个影响转膜的效率
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15楼2011-01-10 11:44:59
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huangwensh

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):虽然你是求助者，但是积极的交流也是值得2金币相送。 2011-01-12 07:56:57
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2011-01-10 11:44:59:
一，蛋白的丰度够不够
二，确保一抗没问题
三，蛋白大小，这个影响转膜的效率

谢谢，不好意思没金币赠送了，呵呵，前两个问题我不太确定，第三个问题，我想转膜应该问题不大，因为我的marker转的不错，我想蛋白应该 转上了，我再考虑一下前两个问题，谢谢
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16楼2011-01-10 16:13:53
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pidou213

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-10 16:13:53:

  
谢谢，不好意思没金币赠送了，呵呵，前两个问题我不太确定，第三个问题，我想转膜应该问题不大，因为我的marker转的不错，我想蛋白应该 转上了，我再考虑一下前两个问题，谢谢

我的marker转的也不错，但是丽春红染色效果好差啊
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17楼2011-01-10 20:38:41
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-10 11:09:41:


是的我做了好多次，这些浓度都试过了，每张膜上刚开始是8个样，后来条件老不对，我怕浪费样品就每张膜上上了四个样了，

那一定需要好多膜吧？还有你做丽春红染色鉴定吗？
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18楼2011-01-10 20:39:22
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huangwensh

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2011-01-12 07:57:13
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-10 20:39:22:



那一定需要好多膜吧？还有你做丽春红染色鉴定吗？

我一般不鉴定，有时候也鉴定，如果有蛋白会有条带，是需要好多膜，呵呵，我用的是PVDF膜，但是我做的是大分子，一直没爆出来，所以下次我想改用NC膜做一次，听说NC膜亲和力比pvdf膜好一些，
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19楼2011-01-11 10:18:34
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-10 20:38:41:



我的marker转的也不错，但是丽春红染色效果好差啊

那会不会是你提的蛋白质量不行啊，
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20楼2011-01-11 10:19:53
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你将蛋白直接点在NC膜上，做个杂交看见能出来不。
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21楼2011-01-11 11:27:05
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-11 10:19:53:


那会不会是你提的蛋白质量不行啊，

我加阳性对照了啊
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22楼2011-01-12 00:15:04
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pidou213

木虫 (正式写手)
reasonspare:哈哈，就是杂教预试验，用来监测你的抗体的有效性，蛋白样品不用分离，直接点膜，剩下的WB的步骤一样。有信号说明抗体还可以（但不排除非特意） 2011-01-12 08:00:20
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2011-01-11 11:27:05:
你将蛋白直接点在NC膜上，做个杂交看见能出来不。

怎么做杂交？
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23楼2011-01-12 00:15:28
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zx1984 at 2011-01-10 08:57:36:
可能二抗有问题，这种情况我也有过，重新买二抗试试。

我的师姐们和我用的都是同样的二抗，但是他们都做出来了，这样可不可以排除二抗有问题？
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24楼2011-01-12 11:10:30
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zx1984

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-12 11:10:30:


我的师姐们和我用的都是同样的二抗，但是他们都做出来了，这样可不可以排除二抗有问题？

那二抗就应该没问题，看看一抗孵育过夜试试，不行就换一抗，再不行就是样品可能有问题，没办法，western一旦这样就只能一步步的排除原因。
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25楼2011-01-12 12:31:35
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zx1984 at 2011-01-12 12:31:35:

那二抗就应该没问题，看看一抗孵育过夜试试，不行就换一抗，再不行就是样品可能有问题，没办法，western一旦这样就只能一步步的排除原因。

我现在除了一抗没换其他的都试过了，那看来真的是一抗有问题，哎，这是我最不想见到的
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26楼2011-01-12 13:05:22
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lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+2):忽忽~~~ 2011-01-15 01:38:44
整张膜都显色我觉得是封闭没做好，封闭是怎么做的？封闭的时候一定要摇，静置封闭的效果不算太好，当然也可以先在摇床上摇，然后4度静置封闭过夜
还有一种可能就是膜没洗干净，下次洗的时候TBST现配现用，而且一抗洗的时间可以稍微长一点，洗干净是很关键的
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27楼2011-01-12 13:33:26
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lstt09nk at 2011-01-12 13:33:26:
整张膜都显色我觉得是封闭没做好，封闭是怎么做的？封闭的时候一定要摇，静置封闭的效果不算太好，当然也可以先在摇床上摇，然后4度静置封闭过夜
还有一种可能就是膜没洗干净，下次洗的时候TBST现配现用，而且一 ...

TBST需要现用现配？这个我都是陪2L然后能用一星期吧，封闭液是5%的脱脂奶粉，这个事现用现配的，
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28楼2011-01-12 15:05:45
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lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-12 15:05:45:

TBST需要现用现配？这个我都是陪2L然后能用一星期吧，封闭液是5%的脱脂奶粉，这个事现用现配的，

没有说一定要先用现配，但是放时间长了效果会不好。这样的话，膜会洗不干净
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29楼2011-01-14 18:24:48
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kebo050551

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
样品和ACTIN的二抗是一样的吗？ 如果不一样就可能是二抗有问题，我做actin的二抗是鼠抗，抗体非常不好用，背景很黑，
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30楼2011-01-14 20:18:20
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lstt09nk at 2011-01-14 18:24:48:

没有说一定要先用现配，但是放时间长了效果会不好。这样的话，膜会洗不干净

哦，知道啦，谢谢，呵呵
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31楼2011-01-15 13:33:55
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by kebo050551 at 2011-01-14 20:18:20:
样品和ACTIN的二抗是一样的吗？ 如果不一样就可能是二抗有问题，我做actin的二抗是鼠抗，抗体非常不好用，背景很黑，

不一样，一个是抗兔的，一个是抗小鼠的，哦，
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32楼2011-01-15 13:34:48
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pidou213

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-06 21:30:41:
western 曝光actin正常，但是样品却曝不出来，样品整张膜都发光，我试过一抗的浓度从1:500到1:3000都是这种情况，封闭时间最长的时候封闭过夜，却还是整张膜都发光（一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分钟），请问各位 ...

请问你用的是什么公司的试剂盒？

推荐用量是多少？
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33楼2011-01-15 13:49:17
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:05:27:
是不是样品有问题，或者样品处理过程中有问题

再就是抗体了

一抗我们做一般都是1；400

二抗1；4000

你用的是什么公司的一抗啊？为什么用这么高的浓度啊
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34楼2011-01-15 13:49:51
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-15 13:49:51:


你用的是什么公司的一抗啊？为什么用这么高的浓度啊

abcam的推荐浓度，我买了两个一个是这个，一个推荐浓度是10μg/ml-50μg/ml浓度更高啊
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35楼2011-01-15 20:10:59
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gaoyanli

铜虫 (小有名气)
换个封闭液试试吧
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36楼2011-01-16 22:02:48
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by gaoyanli at 2011-01-16 22:02:48:
换个封闭液试试吧

你是说换牛血清白蛋白吗？？？
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37楼2011-01-18 13:00:32
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gaoyanli

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by gaoyanli at 2011-01-16 22:02:48:
换个封闭液试试吧

你可以试一下，我以前也遇到这个问题，换个封闭液就好了
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38楼2011-01-19 16:58:04
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