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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western 结果220KD 蛋白还好， actin竟然让我凌乱了
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athenawj

新虫 (初入文坛)

[交流] western 结果220KD 蛋白还好， actin竟然让我凌乱了

30mA转膜过夜,大蛋白都有，actin竟然杂不出来，图也很诡异。难道是转透了？另外，我在转膜缓冲液里加了SDS，是不是有影响到actin?
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1楼2011-12-06 20:08:27
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athenawj

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by athenawj at 2011-12-06 20:08:27:
30mA转膜过夜,大蛋白都有，actin竟然杂不出来，图也很诡异。难道是转透了？另外，我在转膜缓冲液里加了SDS，是不是有影响到actin?

大家帮分析一下原因呗
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2楼2011-12-06 20:09:46
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athenawj

新虫 (初入文坛)
CCD成像显色
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3楼2011-12-06 20:10:08
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terry130

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
athenawj(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): good 2011-12-06 22:50:44
不会透的，SDS也不会影响。既有可能是你自己样本或者抗体的问题，你有没有跑positive control？
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4楼2011-12-06 21:15:28
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
athenawj(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): good！ 2011-12-06 22:52:42
是不是转过头了呀  过夜 太久了吧  actin只有43KD的样子喔   我记得那时自己做的条件是40mA转40-50min，封闭过夜，杂交效果还是蛮好的 单一的条带，挺漂亮。  GAPDH的就没那么好弄
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5楼2011-12-06 21:58:28
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-12-06 22:54:54
要不按不同条件做个斑点杂交，看看是条件还是抗体本身的问题，也花不了多长时间的
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6楼2011-12-06 22:01:45
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terry130

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by apple6299 at 2011-12-06 21:58:28:
是不是转过头了呀  过夜 太久了吧  actin只有43KD的样子喔   我记得那时自己做的条件是40mA转40-50min，封闭过夜，杂交效果还是蛮好的 单一的条带，挺漂亮。  GAPDH的就没那么好弄

20-30mA 4度转膜过夜是很常用的，尤其是高分子量蛋白，LZ都说了要检测220kd的，所以这种做法很正确。相反，你所说的40mA砖40min还真是少见。。。那么短的时间电流还那么小，分子量稍微大点的蛋白都转不过去吧
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7楼2011-12-07 08:11:37
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athenawj

新虫 (初入文坛)
不知道为什么actin，背景那么黑呢。贴张目的蛋白条带，还算可以点
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8楼2011-12-07 19:36:01
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): Good！ 2011-12-08 18:53:56
引用回帖:
7楼: Originally posted by terry130 at 2011-12-07 08:11:37:
20-30mA 4度转膜过夜是很常用的，尤其是高分子量蛋白，LZ都说了要检测220kd的，所以这种做法很正确。相反，你所说的40mA砖40min还真是少见。。。那么短的时间电流还那么小，分子量稍微大点的蛋白都转不过去吧

是我的疏忽，呵呵，没有考虑到LZ的大目的蛋白。因为当时我的目的蛋白（55KD）和内参actin（43KD）的分子量差别不是非常大，可以一时一起转过去。如果说分子量相差真的较大的话，又怕转过头，应该可以切胶分别按照不同条件转膜的吧。实实验室的其他同学做过类似的。
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9楼2011-12-08 09:18:52
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wangleimin

木虫 (正式写手)
★
athenawj(金币+1):谢谢参与
这么大的目的蛋白，我们一般都是40-90kda的，转膜120分钟，效果很好啊，转膜液中加sds这个也没见过，在电泳时SDS作用是带着蛋白分子往下跑的
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10楼2011-12-08 09:50:42
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athenawj

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by wangleimin at 2011-12-08 09:50:42:
这么大的目的蛋白，我们一般都是40-90kda的，转膜120分钟，效果很好啊，转膜液中加sds这个也没见过，在电泳时SDS作用是带着蛋白分子往下跑的

SDS可以促进大蛋白脱离凝胶进入膜里，也是论坛里看到的
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11楼2011-12-08 21:49:06
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wangleimin

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by athenawj at 2011-12-08 21:49:06:
SDS可以促进大蛋白脱离凝胶进入膜里，也是论坛里看到的

学习中，谢谢
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12楼2011-12-09 19:43:23
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