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汕头大学海洋科学接受调剂
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huangwensh

木虫 (著名写手)


[交流] 【求助/交流】western 曝光actin正常,但是样品却曝不出来

western 曝光actin正常,但是样品却曝不出来,样品整张膜都发光,我试过一抗的浓度从1:500到1:3000都是这种情况,封闭时间最长的时候封闭过夜,却还是整张膜都发光(一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分钟),请问各位是哪里出的问题
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huangwensh

木虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by lstt09nk at 2011-01-12 13:33:26:
整张膜都显色我觉得是封闭没做好,封闭是怎么做的?封闭的时候一定要摇,静置封闭的效果不算太好,当然也可以先在摇床上摇,然后4度静置封闭过夜
还有一种可能就是膜没洗干净,下次洗的时候TBST现配现用,而且一 ...

TBST需要现用现配?这个我都是陪2L然后能用一星期吧,封闭液是5%的脱脂奶粉,这个事现用现配的,
28楼2011-01-12 15:05:45
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feng__

金虫 (著名写手)



huangwensh(金币+1): 2011-01-07 10:19:19
最爱花诗雨(金币+1):good 2011-01-07 10:23:09
是不是样品有问题,或者样品处理过程中有问题

再就是抗体了

一抗我们做一般都是1;400

二抗1;4000
2楼2011-01-07 10:05:27
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huangwensh

木虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:05:27:
是不是样品有问题,或者样品处理过程中有问题

再就是抗体了

一抗我们做一般都是1;400

二抗1;4000

那我的actin曝出来都很正常,样品是不是不该有问题啊?
3楼2011-01-07 10:18:59
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feng__

金虫 (著名写手)


★ ★
dhd997(金币+2):good 2011-01-07 16:40:31
huangwensh(金币+3): 2011-01-07 16:58:42
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-07 10:18:59:



那我的actin曝出来都很正常,样品是不是不该有问题啊?

恩,考虑下抗体的问题,再多做几次,有的时候是这样的,当时我跟同学在一块胶上跑样品,我的结果就很好,他的就出不来,后来再做就又出来了,也不知道到底是哪里出问题了,还有,你的样品是什么啊?细胞表达的蛋白吗?如果是的话,分清楚是胞外表达还是胞内,核内,如果是后者,那actin表达,你的样品不表达也是正常的,要破碎细胞壁,细胞核!呵呵,自己的一点小经验
4楼2011-01-07 10:38:07
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