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汕头大学海洋科学接受调剂
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huangwensh

木虫 (著名写手)


[交流] 【求助/交流】western 曝光actin正常,但是样品却曝不出来

western 曝光actin正常,但是样品却曝不出来,样品整张膜都发光,我试过一抗的浓度从1:500到1:3000都是这种情况,封闭时间最长的时候封闭过夜,却还是整张膜都发光(一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分钟),请问各位是哪里出的问题
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zx1984

木虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-12 11:10:30:


我的师姐们和我用的都是同样的二抗,但是他们都做出来了,这样可不可以排除二抗有问题?

那二抗就应该没问题,看看一抗孵育过夜试试,不行就换一抗,再不行就是样品可能有问题,没办法,western一旦这样就只能一步步的排除原因。
25楼2011-01-12 12:31:35
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查看全部 38 个回答

feng__

金虫 (著名写手)



huangwensh(金币+1): 2011-01-07 10:19:19
最爱花诗雨(金币+1):good 2011-01-07 10:23:09
是不是样品有问题,或者样品处理过程中有问题

再就是抗体了

一抗我们做一般都是1;400

二抗1;4000
2楼2011-01-07 10:05:27
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huangwensh

木虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:05:27:
是不是样品有问题,或者样品处理过程中有问题

再就是抗体了

一抗我们做一般都是1;400

二抗1;4000

那我的actin曝出来都很正常,样品是不是不该有问题啊?
3楼2011-01-07 10:18:59
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feng__

金虫 (著名写手)


★ ★
dhd997(金币+2):good 2011-01-07 16:40:31
huangwensh(金币+3): 2011-01-07 16:58:42
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-07 10:18:59:



那我的actin曝出来都很正常,样品是不是不该有问题啊?

恩,考虑下抗体的问题,再多做几次,有的时候是这样的,当时我跟同学在一块胶上跑样品,我的结果就很好,他的就出不来,后来再做就又出来了,也不知道到底是哪里出问题了,还有,你的样品是什么啊?细胞表达的蛋白吗?如果是的话,分清楚是胞外表达还是胞内,核内,如果是后者,那actin表达,你的样品不表达也是正常的,要破碎细胞壁,细胞核!呵呵,自己的一点小经验
4楼2011-01-07 10:38:07
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