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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】western 曝光actin正常，但是样品却曝不出来
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huangwensh

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】western 曝光actin正常，但是样品却曝不出来

western 曝光actin正常，但是样品却曝不出来，样品整张膜都发光，我试过一抗的浓度从1:500到1:3000都是这种情况，封闭时间最长的时候封闭过夜，却还是整张膜都发光（一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分钟），请问各位是哪里出的问题
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1楼 2011-01-06 21:30:41
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-06 21:30:41:
western 曝光actin正常，但是样品却曝不出来，样品整张膜都发光，我试过一抗的浓度从1:500到1:3000都是这种情况，封闭时间最长的时候封闭过夜，却还是整张膜都发光（一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分钟），请问各位 ...

你是怎么做一抗从1：500到1：3000的呢?是不是要做很多张膜啊？

每张膜上有几个样品呢?

请指教
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7楼2011-01-10 08:52:03
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pidou213

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-10 16:13:53:

  
谢谢，不好意思没金币赠送了，呵呵，前两个问题我不太确定，第三个问题，我想转膜应该问题不大，因为我的marker转的不错，我想蛋白应该 转上了，我再考虑一下前两个问题，谢谢

我的marker转的也不错，但是丽春红染色效果好差啊
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17楼2011-01-10 20:38:41
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-10 11:09:41:


是的我做了好多次，这些浓度都试过了，每张膜上刚开始是8个样，后来条件老不对，我怕浪费样品就每张膜上上了四个样了，

那一定需要好多膜吧？还有你做丽春红染色鉴定吗？
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18楼2011-01-10 20:39:22
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-11 10:19:53:


那会不会是你提的蛋白质量不行啊，

我加阳性对照了啊
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22楼2011-01-12 00:15:04
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pidou213

木虫 (正式写手)
reasonspare:哈哈，就是杂教预试验，用来监测你的抗体的有效性，蛋白样品不用分离，直接点膜，剩下的WB的步骤一样。有信号说明抗体还可以（但不排除非特意） 2011-01-12 08:00:20
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2011-01-11 11:27:05:
你将蛋白直接点在NC膜上，做个杂交看见能出来不。

怎么做杂交？
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23楼2011-01-12 00:15:28
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pidou213

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-06 21:30:41:
western 曝光actin正常，但是样品却曝不出来，样品整张膜都发光，我试过一抗的浓度从1:500到1:3000都是这种情况，封闭时间最长的时候封闭过夜，却还是整张膜都发光（一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分钟），请问各位 ...

请问你用的是什么公司的试剂盒？

推荐用量是多少？
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33楼2011-01-15 13:49:17
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:05:27:
是不是样品有问题，或者样品处理过程中有问题

再就是抗体了

一抗我们做一般都是1；400

二抗1；4000

你用的是什么公司的一抗啊？为什么用这么高的浓度啊
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34楼2011-01-15 13:49:51
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