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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教霉菌生长曲线测定方法
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冼亮淀粉酶

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scelab(金币+10, EPI+1): 热心鼓励 2011-07-02 09:50:07
这张帖子被引用作为另一个帖子所提问题的解答，我好奇地进来看了一下，觉得这张帖子的问题还是没有解决，虽然帖子是老了一点，但是问题解决了却是好事。

首先讨论测定吸光度的问题。我培养过曲霉属（包括黑曲霉、黄曲霉、米曲霉、塔宾曲霉、棘孢曲霉、黄柄曲霉、亮白曲霉等）、青霉属（包括草酸青霉、嗜松青霉等），枝状枝孢霉种，根霉属，木霉属，还有很多没有鉴定过的真菌，超过一千株，发现除非是污染了细菌，不然真菌在液体培养（180rpm）时菌丝长了之后都会相互纠结成球或块状，所以测定OD值不能反映真菌的生长时期。假如培养液离心之后测定OD值，那么没有菌体存在了；假如不离心，那么取菌体不能反应培养液中菌体的含量，而且如果菌体恰好挡住了光栅投射点，那么就完全吸光，没有任何光透过，引起误差。所以就别想着测定OD值了，细菌可以，真菌不适合。

再来看看测定菌丝干重的问题。首先应该肯定这个方法，因为这个方法已经把菌丝考虑进去了，大方向没有错，但是细节却很需要注意，因为取样量要真实反映菌丝的含量，而且还要保持培养液体系的完整。第一，取样量要真实反映菌丝的含量存在困难，因为真菌是有菌丝的，菌丝一旦长了就容易纠结在一起成块或者球状，需要摇均匀才能取样，但是怎样才算均匀呢？这是不确定因素。第二，保持培养液体系的完整也存在困难，因为取样的过程中需要无菌操作，这个取样品过程是否能保持无菌操作，不让细菌长起来，存在隐患；第二，一瓶培养基取样多次之后还剩下多少毫升？会不会开始的时候是100毫升，七天之后只剩下50毫升？还有，在摇床或者发酵罐中，空气的流动也会带走水分的，会不会开始的时候是100毫升，七天之后取样10次每次5毫升，最后只剩下30毫升？

我有个办法可以避免上面提到的这些问题，那就是将这个真菌制取孢子悬浮液（浓度不在此处讨论），以相同的接种量接种到足够数量的相同体积的液体培养基中，在同一条件下培养，在每个取样时间点取出3瓶培养基用布氏漏斗抽滤，在烘箱中50-60度烘干至恒重，称重。这样做虽然工作量大了些，但排除了多次取样操作带来的细菌污染的隐患，液体体积变化的变数，直接反映了菌丝生长的时期，数据可信。
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jiaoyu189
13楼2011-07-02 01:08:32
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iaminxanadu

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scelab(金币+10, EPI+1): 热心鼓励 2011-07-02 09:50:27
首先应该透彻了解生长曲线的意义，为什么去做这个曲线？

微生物学引进生长曲线的概念来描述其生长与时间的关系。这个关系的意义在于使我们能更好把握它不同时期的生长状况。了解了这点不仅可以描述一些数量关系——定量，可以对其定性。（比如长大什么阶段。。。），有了这个关系，可以方便的进行人为干涉微生物生命活动。

有了这些认识，就不必纠结于“传统的”生长曲线做法。

大家提出的办法，可以去尝试。但我觉得有所不妥：

首先，OD值的测量已有解释，在真菌甚至一些链霉菌中均不适用。
其次，13楼工作量不小，而且遇到某些情形也不适宜。比如培养基中有大的颗粒物质或纤维

那么有没有切实可行的方法呢？
这个问题实在是没有意义的问题。为什么要拘泥于生长曲线呢？生长曲线只反映了微生物学及工业发酵最初的认识，即biomass。大家关切这个单位的目的还不是为了调节生命活动吗？只因为这个单位能反映内在的代谢状况而已。

所以问题就转换成了，怎样选择其他“单位”来反映菌体内在代谢过程。

只要你找到了能衡量、定性某一培养体系的其他关系就行。


工业上，常用PMV来衡量菌体生长状况。这就是个好办法。

其实还有很多办法去解决实际问题。pH 是大家最常用的，但往往只是绘制了体系的pH随培养时间的变化曲线而已，不加以利用。

有其他的“单位”吗？当然有，还很多。简单点的比如耗糖，总氮。这些都不陌生。很多人都是为了做个生长曲线而做曲线。

复杂的还可以测NADH之类的，甚至莫一种关键的代谢物及酶的活动情况。

唠叨一句：当年我硕士论文被中国农大的一个教授毙了。原因就是：没有生长曲线！
我做的是真菌啊！而且发酵培养基里有N多东西，什么稻草粉，什么树皮，什么麦麸。。。。
这叫我情何以堪！

总之，我个人理解，解决问题有很多办法，没必要去强求或执着地走一条路。做生长曲线如此，做其他的也是如此吧。
欢迎讨论，进步就在讨论中。
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14楼2011-07-02 09:13:43
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冼亮淀粉酶

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rainwander(金币+6): 不错的解答，辛苦了 2011-07-04 17:51:41
rainwander(EPI+1): 2011-07-04 17:51:46
引用回帖:
Originally posted by iaminxanadu at 2011-07-02 09:13:43:
首先应该透彻了解生长曲线的意义，为什么去做这个曲线？

微生物学引进生长曲线的概念来描述其生长与时间的关系。这个关系的意义在于使我们能更好把握它不同时期的生长状况。了解了这点不仅可以描述一些数量关系 ...

首先，培养基里如果有固体物质不利于微生物降解吸收，花生麸、豆粕、玉米、大米、马铃薯、木薯都要先将其粉碎，用80目筛子过滤取细粉，这样基质的表面积就增大，利于酶对其降解，要不然，大块的基质可能一直到菌丝老死都不能被利用完。当基质被粉碎后，可以很轻松地用滤布过滤除去，不影响真菌生长曲线的测定。你的树皮什么的有没有粉碎后过80目筛子取细粉，有没有用多少层纱布过滤取菌体？或者如果没有粉碎，是不是出于什么不得已的原因？是贴近工业生产要求还是怎么样？硕士学位论文一般不会被枪毙的，我代导师盲审过，我想枪毙那本学位论文导师都不让，最后我费劲脑汁去想在哪里能加分才好不容易凑足60分。你因为没做生长曲线而被枪毙，生长曲线在硕士论文中占那么大的比重？我很好奇是怎样的论文，能否透露一下？如果你签了保密协议，那就在保密期间看不了，就没办法了。那么你现在这个学位问题是怎样解决的，是不是重新做了生长曲线？怎样做的？

PMV的全称为package mycelium volume，即在一定的转速下离心得到菌丝体积百分比，但是真菌在生长对数期时菌丝和菌丝球是相互排斥，不能彻底离心下去的，不能测量其体积，所以也不靠谱。我在做果糖基转移酶的时候需要将培养1天的黑曲霉、棘孢曲霉、黄柄曲霉和塔宾曲霉离心收集菌体，结果就是离心不好。或者说可能我的实验如此，你的实验可能不是这样的，你当初培养的是什么真菌，用这个方法来做得到可信的结果的？

pH值的测定极其不靠谱，因为培养基里成分复杂，而且真菌在生长过程中，培养液里的pH值有可能变化极小，像我做的一株嗜松青霉，七天之内一直在6.0左右，对于这个青霉来说，七天已经差不多over了，pH值不能反映其生长周期。

耗糖，碳源可以是多糖，但是总糖不是全都是由碳源而生，因为氮源也含有碳，糖是羟基酮和醛，能不能确保加进去的氮源也不会产生糖？这个我没有做过，只是提个疑问和你探讨一下。

氮源和NADH我没有做过，如果你方便，关于原理和操作方法，可不可以提供些文献来让大家学习一下？我也想学习。
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15楼2011-07-02 16:39:18
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iaminxanadu

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rainwander(金币+6, EPI+1): 鼓励 2011-07-04 17:51:57
真正的工业化的过程考虑到成本，很多东西不可能去要求做到多少目的。这种情形是我亲身经历的。当然不只是我一个人的经历，国外的工业化过程也是如此。我未亲自去国外的工厂看，但他们来交流，也是存在和实验室过程很大的不同。
医药工业上生产一种脂肪酶抑制剂，发酵液很粘稠，根本不能去分离菌体与其他发酵组分的，只能用糖、pH来控制生长状况。
再比如一种免疫抑制剂的生产，也从不需要去考察这种菌的生长曲线，直接pmv，同时记录溶氧来进行发酵控制。
很多，我接触了大概六七个工业化项目，只有E.coli检测生长曲线。

工业上所做的一切都是为了操作可行。就拿PMV来说，不是说这个单位可以替代什么，至少我们不需要落入“生长曲线”测定上。因为只要找到一个能进行人为干预调节菌体代谢的，目的就行了。生长曲线最根本的价值只在于，也只能在于我们利用这个指标，进行人为控制菌体代谢。否则就是去了它存在的意义。我们能找到其他的方法时就没必要去费力的去获得这条曲线。

当年做的硕士论文是农业副产物利用，教育厅的课题。考虑实际的成本，不可能要求底物做到多少物的。

事实上，工业上的很多补料过程不是看什么“生长曲线”而是看其他指标，很多用pH结合总糖等指标进行。
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17楼2011-07-02 20:49:34
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rainwander(EPI+1): 2011-07-04 17:52:28
你说的这些我全都赞同，你说的补料确实是为了追求更高的产量，产量和生物量也是不一定对应的，当产量上升的时候，生物量不一定上升。我认为在工厂里做补料测产量而看轻生长曲线有以下原因：

1、工厂追求产量。产量就是产值，怎样做得好就怎样做，不用追求数据的完整性，对他们来说，生物量只是一项可有可无的数据，工厂要的是钱，所以采用最直接的方法。比如说什么pH值下发酵效果最好，他们可以把麦麸豆柏一股脑儿加下去，用硫酸调节pH值，发酵的时候测定产量就行，不用关心微生物长势如何的，太酸或碱了不长，不要紧，测产量就行，不用管微生物的生活质量。

2、工厂的实验室没有发表文章的压力，也不想把自己的生产经验给竞争对手分享，所以不会注意收集很多数据，使得实验完整，包括生长曲线这一项，更不会讨论生长曲线和产量的关系。当然，工厂要发表文章也是可以，但是会谨慎得多。

3、工厂的实验室可能没有做更高深实验所需的器材和药品。例如一个酒精厂，最贵的就是一台九十年代产的HPLC，测定一下有没有甘油之类的，其它的不用买。要说测定糖化用的根霉的长势如何，那肯定是测定不了的。

4、工厂这样做是经过摸索的，什么时候控制什么能得到什么结果，他们已经做过很多这种优化实验了，也许他们在摸索的时候测过生长曲线，但在生产的时候是采用成熟的路线来做的，所以也就不用再测了。也许在再摸索的时候会测定一下吧，到那时候可能就知道他们是怎样测定的了。

实验室的结果要经过小试、中试、工厂试验，规模逐渐加大，加上在扩大化的过程中会发现很多新问题，所以投入的人力物力是很大的，时间也很久，说十年都有可能。用来做试验，希望得到能创收的生物材料也会从最初的100种，到最后确定下来的一种，可能是百里挑一。我们的酵母曾经给中粮试过，但数据比不上我们在实验室做的好，到了工厂之后就比不上安琪酵母了，我们也正在进行选育，争取对安琪酵母有更大的优势。中粮试过的酵母不止是安琪酵母，也有全国各地的公司和实验室的酵母品种，所以这个战况也是惨烈的。

仔细看了你的两个回帖，觉得你并没有说明应该采用什么方法来测定生长曲线，更像是说生长曲线该不该测定。你想表达的意思似乎是“生长曲线不一定有必要测定，而应该更注重于某些目标产物的产量，以求更可能得到实际利益。为了得到更高的产量，可以考虑优化发酵条件，包括中间补料和控制pH值等”，是吗？我觉得这应该是学生和导师交流之后，最终由导师来作决定的，我没有想到楼主是不是应该问一下导师“是不是非要测定生长曲线不可”这个问题。
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19楼2011-07-03 00:23:52
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iaminxanadu

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rainwander(金币+5, EPI+1): 鼓励 2011-07-04 17:52:55
确实是这样的，什么事都会遇到。导师基本不会过问论文的，所有的东西都由自己来做。我承认没有导师会走弯路，但好处会更多的。包括所有我现在掌握的大部分仅仅依靠的就是文献和书籍，加上自己不断实验累积。其余的就是工作后向车间工人学习的。

当时的情形就是所有底物均为粗品，整个体系也不是均一的。那个教授坚决要求补实验才可以答辩。他根本没有看我的论文或者真的不太了解实际情形吧。
况且，事后我导师也认为没必要去测这个生长曲线。当时的情形，大概6、7年前吧，做微生物的，这个曲线很流行呢。但即便现在再去做那个课题，我想也是没必要的。


不可否认“生长曲线”在整个生物学里都很重要，不管是做微生物的还是做其他的。这个概念最大的好处是直观性，很多论文现在也提及这一指标。

我所表达的也是这个意思，不是反对或提出怎样测生长曲线。

首先，看这个曲线有无必要去测。
其次，在实际中的可操作性。
三、殊途同归。达到目的才是根本。


  另外，公司里也不像多少年前那样了，基本大型企业都有自己的研发中心了。可能只是更多的处于一个“摆样子”的地位。但这并不妨碍想做东西的人来利用这些资源。
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21楼2011-07-03 08:58:44
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