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【求助/交流】请教霉菌生长曲线测定方法
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| 我要测定霉菌的生长曲线，但是细菌那种测定方法好象不行，请高人指点， |
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scelab(金币+10, EPI+1): 热心鼓励 2011-07-02 09:50:07
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scelab(金币+10, EPI+1): 热心鼓励 2011-07-02 09:50:07
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这张帖子被引用作为另一个帖子所提问题的解答，我好奇地进来看了一下，觉得这张帖子的问题还是没有解决，虽然帖子是老了一点，但是问题解决了却是好事。 首先讨论测定吸光度的问题。我培养过曲霉属（包括黑曲霉、黄曲霉、米曲霉、塔宾曲霉、棘孢曲霉、黄柄曲霉、亮白曲霉等）、青霉属（包括草酸青霉、嗜松青霉等），枝状枝孢霉种，根霉属，木霉属，还有很多没有鉴定过的真菌，超过一千株，发现除非是污染了细菌，不然真菌在液体培养（180rpm）时菌丝长了之后都会相互纠结成球或块状，所以测定OD值不能反映真菌的生长时期。假如培养液离心之后测定OD值，那么没有菌体存在了；假如不离心，那么取菌体不能反应培养液中菌体的含量，而且如果菌体恰好挡住了光栅投射点，那么就完全吸光，没有任何光透过，引起误差。所以就别想着测定OD值了，细菌可以，真菌不适合。 再来看看测定菌丝干重的问题。首先应该肯定这个方法，因为这个方法已经把菌丝考虑进去了，大方向没有错，但是细节却很需要注意，因为取样量要真实反映菌丝的含量，而且还要保持培养液体系的完整。第一，取样量要真实反映菌丝的含量存在困难，因为真菌是有菌丝的，菌丝一旦长了就容易纠结在一起成块或者球状，需要摇均匀才能取样，但是怎样才算均匀呢？这是不确定因素。第二，保持培养液体系的完整也存在困难，因为取样的过程中需要无菌操作，这个取样品过程是否能保持无菌操作，不让细菌长起来，存在隐患；第二，一瓶培养基取样多次之后还剩下多少毫升？会不会开始的时候是100毫升，七天之后只剩下50毫升？还有，在摇床或者发酵罐中，空气的流动也会带走水分的，会不会开始的时候是100毫升，七天之后取样10次每次5毫升，最后只剩下30毫升？ 我有个办法可以避免上面提到的这些问题，那就是将这个真菌制取孢子悬浮液（浓度不在此处讨论），以相同的接种量接种到足够数量的相同体积的液体培养基中，在同一条件下培养，在每个取样时间点取出3瓶培养基用布氏漏斗抽滤，在烘箱中50-60度烘干至恒重，称重。这样做虽然工作量大了些，但排除了多次取样操作带来的细菌污染的隐患，液体体积变化的变数，直接反映了菌丝生长的时期，数据可信。 |
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jiaoyu18913楼2011-07-02 01:08:32
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rainwander(金币+6): 不错的解答，辛苦了 2011-07-04 17:51:41
rainwander(EPI+1): 2011-07-04 17:51:46
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rainwander(EPI+1): 2011-07-04 17:51:46
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首先，培养基里如果有固体物质不利于微生物降解吸收，花生麸、豆粕、玉米、大米、马铃薯、木薯都要先将其粉碎，用80目筛子过滤取细粉，这样基质的表面积就增大，利于酶对其降解，要不然，大块的基质可能一直到菌丝老死都不能被利用完。当基质被粉碎后，可以很轻松地用滤布过滤除去，不影响真菌生长曲线的测定。你的树皮什么的有没有粉碎后过80目筛子取细粉，有没有用多少层纱布过滤取菌体？或者如果没有粉碎，是不是出于什么不得已的原因？是贴近工业生产要求还是怎么样？硕士学位论文一般不会被枪毙的，我代导师盲审过，我想枪毙那本学位论文导师都不让，最后我费劲脑汁去想在哪里能加分才好不容易凑足60分。你因为没做生长曲线而被枪毙，生长曲线在硕士论文中占那么大的比重？我很好奇是怎样的论文，能否透露一下？如果你签了保密协议，那就在保密期间看不了，就没办法了。那么你现在这个学位问题是怎样解决的，是不是重新做了生长曲线？怎样做的？ PMV的全称为package mycelium volume，即在一定的转速下离心得到菌丝体积百分比，但是真菌在生长对数期时菌丝和菌丝球是相互排斥，不能彻底离心下去的，不能测量其体积，所以也不靠谱。我在做果糖基转移酶的时候需要将培养1天的黑曲霉、棘孢曲霉、黄柄曲霉和塔宾曲霉离心收集菌体，结果就是离心不好。或者说可能我的实验如此，你的实验可能不是这样的，你当初培养的是什么真菌，用这个方法来做得到可信的结果的？ pH值的测定极其不靠谱，因为培养基里成分复杂，而且真菌在生长过程中，培养液里的pH值有可能变化极小，像我做的一株嗜松青霉，七天之内一直在6.0左右，对于这个青霉来说，七天已经差不多over了，pH值不能反映其生长周期。 耗糖，碳源可以是多糖，但是总糖不是全都是由碳源而生，因为氮源也含有碳，糖是羟基酮和醛，能不能确保加进去的氮源也不会产生糖？这个我没有做过，只是提个疑问和你探讨一下。 氮源和NADH我没有做过，如果你方便，关于原理和操作方法，可不可以提供些文献来让大家学习一下？我也想学习。 |
15楼2011-07-02 16:39:18
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rainwander(EPI+1): 2011-07-04 17:52:28
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rainwander(EPI+1): 2011-07-04 17:52:28
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你说的这些我全都赞同，你说的补料确实是为了追求更高的产量，产量和生物量也是不一定对应的，当产量上升的时候，生物量不一定上升。我认为在工厂里做补料测产量而看轻生长曲线有以下原因： 1、工厂追求产量。产量就是产值，怎样做得好就怎样做，不用追求数据的完整性，对他们来说，生物量只是一项可有可无的数据，工厂要的是钱，所以采用最直接的方法。比如说什么pH值下发酵效果最好，他们可以把麦麸豆柏一股脑儿加下去，用硫酸调节pH值，发酵的时候测定产量就行，不用关心微生物长势如何的，太酸或碱了不长，不要紧，测产量就行，不用管微生物的生活质量。 2、工厂的实验室没有发表文章的压力，也不想把自己的生产经验给竞争对手分享，所以不会注意收集很多数据，使得实验完整，包括生长曲线这一项，更不会讨论生长曲线和产量的关系。当然，工厂要发表文章也是可以，但是会谨慎得多。 3、工厂的实验室可能没有做更高深实验所需的器材和药品。例如一个酒精厂，最贵的就是一台九十年代产的HPLC，测定一下有没有甘油之类的，其它的不用买。要说测定糖化用的根霉的长势如何，那肯定是测定不了的。 4、工厂这样做是经过摸索的，什么时候控制什么能得到什么结果，他们已经做过很多这种优化实验了，也许他们在摸索的时候测过生长曲线，但在生产的时候是采用成熟的路线来做的，所以也就不用再测了。也许在再摸索的时候会测定一下吧，到那时候可能就知道他们是怎样测定的了。 实验室的结果要经过小试、中试、工厂试验，规模逐渐加大，加上在扩大化的过程中会发现很多新问题，所以投入的人力物力是很大的，时间也很久，说十年都有可能。用来做试验，希望得到能创收的生物材料也会从最初的100种，到最后确定下来的一种，可能是百里挑一。我们的酵母曾经给中粮试过，但数据比不上我们在实验室做的好，到了工厂之后就比不上安琪酵母了，我们也正在进行选育，争取对安琪酵母有更大的优势。中粮试过的酵母不止是安琪酵母，也有全国各地的公司和实验室的酵母品种，所以这个战况也是惨烈的。 仔细看了你的两个回帖，觉得你并没有说明应该采用什么方法来测定生长曲线，更像是说生长曲线该不该测定。你想表达的意思似乎是“生长曲线不一定有必要测定，而应该更注重于某些目标产物的产量，以求更可能得到实际利益。为了得到更高的产量，可以考虑优化发酵条件，包括中间补料和控制pH值等”，是吗？我觉得这应该是学生和导师交流之后，最终由导师来作决定的，我没有想到楼主是不是应该问一下导师“是不是非要测定生长曲线不可”这个问题。 |
19楼2011-07-03 00:23:52
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20楼2011-07-03 00:31:48