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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】SDS-PAGE电泳问题
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shyuyafeng

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】SDS-PAGE电泳问题

我跑的样品是蛋白，最近跑电泳的时候，样品刚进入分离胶的时候成线状，但是过了一会就开始弥散，昨天今天都是这样，昨天浓缩胶是80v，分离胶是100v，昨天晚上看了点资料别人说可能是电压的问题，今天把分离胶的电压降低了还是弥散。分离胶和浓缩胶的pH没有问题，电泳液也是新配的，
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1楼2010-11-13 15:53:10
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shyuyafeng

木虫 (正式写手)
rainwander:找到原因就好。我做的时候都是混合加热8-15分钟，跑之前离心1min，跑完之后染色，没问题。 2010-12-12 16:33:12
引用回帖:
Originally posted by piaopiao233 at 2010-11-16 17:16:19:
已经发现问题了，是什么原因呢？让大家都借鉴一下啊

恩，我觉得主要的问题是，我的样品和buffer融合之后加热到100度这个时间有点短，平时都是3min中，这次我延长到了8分钟，这样使蛋白质和SDS充分结合，然后在上样之前我又离心了一遍，2min，最后跑的条带就很好，基本上没有弥散和拖尾了。
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19楼2010-11-16 21:09:03
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chemifunan

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):感谢交流 2010-11-17 11:11:57
哦 对的 上样前是要离心 忘了说了

上次是说 装溴酚兰母液的瓶子也会沉淀 就是在往蛋白里加之前 煮之前的时候 装溴酚兰变性液 也离一下 取上层的加到蛋白样品里 5* stock就是1:4 不要太多 然后沸水浴8分钟 (过长会断掉一些蛋白 10min内不会 但是楼主你3min是短了 前沿弥散可能和溴酚兰过量有关系) 再离心 12000rpm 1min 取上清PAGE 就可以了
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25楼2010-11-17 09:25:07
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普通回帖

375433261

新虫 (小有名气)
★ ★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-13 16:03:39
应该不是电压的问题，我就是用这样的电压跑的 ，跑出的条带挺好的，应该是你的样品浓度太高了，或者是分离胶的配方有问题 电压肯定是没问题的
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2楼2010-11-13 15:59:37
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hwamg

银虫 (正式写手)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
弥撒是不是你的交联剂temed有问题或配比当啊 电压我们浓缩80v  分离胶120v
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3楼2010-11-13 16:36:06
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shyuyafeng

木虫 (正式写手)
★ ★
scelab:编辑内容 2010-11-13 18:49
scelab:我帮你传了上来~~~ 2010-11-13 18:50:16
silicare(金币+2):鼓励上图 2010-11-15 17:22:10
内容已删除
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4楼2010-11-13 17:40:36
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shyuyafeng

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 375433261 at 2010-11-13 15:59:37:
应该不是电压的问题，我就是用这样的电压跑的 ，跑出的条带挺好的，应该是你的样品浓度太高了，或者是分离胶的配方有问题 电压肯定是没问题的

15%的分离胶 配方是按分子生物手册上配的肯定没问题，样品浓度高会导致弥散吗？
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5楼2010-11-13 17:51:23
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shyuyafeng

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hwamg at 2010-11-13 16:36:06:
弥撒是不是你的交联剂temed有问题或配比当啊 电压我们浓缩80v  分离胶120v

TE是买的现成的，应该没有问题，配比是按分子生物手册上配的，没有问题啊。
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6楼2010-11-13 17:53:10
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一夜不留痕

银虫 (初入文坛)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
兄弟 你跑的是不是tricine胶 也就是三层胶呀  如果是的话 可能是负极电泳液弄错了  PH出问题了或者是没有加SDS
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7楼2010-11-15 12:49:36
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by shyuyafeng at 2010-11-13 17:51:23:


15%的分离胶 配方是按分子生物手册上配的肯定没问题，样品浓度高会导致弥散吗？

只知道样品盐浓度高会导致电泳条带弥散。不清楚浓度的影响。
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8楼2010-11-15 12:56:29
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wyf10071121

新虫 (初入文坛)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
我试验的时候也出现了这样的情况，不过还好了最后不影响后续的试验啊！
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9楼2010-11-15 13:28:09
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piaopiao233

金虫 (小有名气)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
是多大的蛋白质啊，要用到这个浓度的胶吗？
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10楼2010-11-15 14:01:36
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shyuyafeng

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by piaopiao233 at 2010-11-15 14:01:36:
是多大的蛋白质啊，要用到这个浓度的胶吗？

分子量大概在20kd-30kd。
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11楼2010-11-15 17:07:19
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shyuyafeng

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 一夜不留痕 at 2010-11-15 12:49:36:
兄弟 你跑的是不是tricine胶 也就是三层胶呀  如果是的话 可能是负极电泳液弄错了  PH出问题了或者是没有加SDS

不是啊，我的两层胶，分离胶和浓缩胶~
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12楼2010-11-15 17:14:25
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shyuyafeng

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wyf10071121 at 2010-11-15 13:28:09:
我试验的时候也出现了这样的情况，不过还好了最后不影响后续的试验啊！

那你染色后小分子量的条带能看清楚吗？
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13楼2010-11-15 17:16:44
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piaopiao233

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-15 23:08:44
shyuyafeng(金币+3):谢谢，我已经发现问题了。 2010-11-16 16:52:29
你看的时候不光要看电压
一般我们是保持电流的恒定，所以有时候电压会上下浮动一点，要不然会跑的很慢之类的。
还有你的样品是怎么制得的？上样缓冲液有没有什么问题？你的蛋白marker在电泳过程中也出现弥散吗？
建议你先看看样品，确定没什么问题再看胶。
以前这个仪器别人用的时候有没有什么问题？换个浓度试试？换别人的样试一试？
多试几次肯定就明白了
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14楼2010-11-15 19:15:51
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xqlcjy

银虫 (小有名气)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
同意楼上的，还是先看看你的MARKER，如果你的MARKER没有问题，说明你加样就有问题了
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15楼2010-11-15 21:58:12
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luohuijun

木虫 (小有名气)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
看样子应该是样品量加多了，你减少量，调一下分离胶与浓缩胶的比例。
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16楼2010-11-16 16:51:14
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piaopiao233

金虫 (小有名气)
已经发现问题了，是什么原因呢？让大家都借鉴一下啊
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17楼2010-11-16 17:16:19
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chemifunan

木虫 (正式写手)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
shyuyafeng(金币+4): 2010-11-16 21:09:16
楼主同学 这个正常 不算弥散 样品是否弥散要染色后看你的目标条带的情况才知道 跑的时候看到的是溴酚兰 溴酚兰跑花了不代表条带跑花 在电泳中 确实也有溴酚兰从头到尾是一条细线的时候 （虽然这也不代表你的样品不弥散 这两件事不是没有关系 而是没有必然的关系） 毕竟这样好看一点 我没仔细分析过这个原因和技巧 只要染色过后我要的band清楚就行了

如果各种溶液没问题的话 那我觉得和配的溴酚兰有关 溴酚兰不要上太多 母液用之前离心一下 去掉里面的沉淀物 如果还不行 看看换个电泳槽 不同的电泳槽状态不一样 冒泡的速度都不一样

但是不影响你看结果 我觉得不用搞这么紧张
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18楼2010-11-16 19:51:22
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shyuyafeng

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-11-16 19:51:22:
楼主同学 这个正常 不算弥散 样品是否弥散要染色后看你的目标条带的情况才知道 跑的时候看到的是溴酚兰 溴酚兰跑花了不代表条带跑花 在电泳中 确实也有溴酚兰从头到尾是一条细线的时候 （虽然这也不代表你的样品不 ...

恩，我今天跑的样就很好，可能就如你说的上样前离心一下效果不错。
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20楼2010-11-16 21:11:20
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qutao1720

金虫 (小有名气)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
可能是样品里的盐浓度高啦
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21楼2010-11-16 21:31:08
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
你的样品是什么呀？蛋白是溶解在什么里的？
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22楼2010-11-16 22:09:34
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xjyxhyxqh

木虫 (正式写手)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
从照片来看，你跑得没有问题。下面的那种拖尾，有时是正常的。你染色后就知道了。
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23楼2010-11-16 22:34:10
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xiong86yu

金虫 (正式写手)
★
shyuyafeng(金币+1):谢谢参与
估计还是浓度问题，
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24楼2010-11-16 22:36:57
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piaopiao233

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by shyuyafeng at 2010-11-16 21:11:20:

恩，我今天跑的样就很好，可能就如你说的上样前离心一下效果不错。

哦这样啊，我们一般煮5min。而且注意一下，要在水开了放进去，要不然时间是不对的，可能煮了半天还是不开的水，不到100℃
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26楼2010-11-17 11:12:54
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2009227004

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by shyuyafeng at 2010-11-16 21:09:03:

恩，我觉得主要的问题是，我的样品和buffer融合之后加热到100度这个时间有点短，平时都是3min中，这次我延长到了8分钟，这样使蛋白质和SDS充分结合，然后在上样之前我又离心了一遍，2min，最后跑的条带就很好， ...

我们一般加热都是95度10分钟。。。。
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27楼2010-11-17 14:23:24
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2009227004

金虫 (正式写手)
其实散一点也还好，只要跑出来的蛋白 没有什么问题就OK了
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28楼2010-11-17 14:24:24
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muziyu1024

金虫 (小有名气)
样品pH的问题
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29楼2010-12-02 00:13:01
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我遇见过一次，后来发现是电流过大的原因
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30楼2010-12-02 08:44:47
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
应该是胶浓度没有调整好，或者是TEMED问题，交联的不够好，现在气温低，可能有影响，你可以灌好上层胶后放在37℃ 的培养箱里让之凝固，快而且好
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31楼2010-12-02 08:53:32
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jessica533

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):反了电流不通 就下不去了 2010-12-02 12:08:42
你的塑料对称板似乎放反了哎
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32楼2010-12-02 10:30:39
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jessica533

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我是说不加样品的对称板放反了，反了也没什么了，并不妨碍电路，只是也许会漏缓冲液，多加点缓冲液就ok了
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33楼2010-12-03 09:13:03
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shyuyafeng

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by jessica533 at 2010-12-03 09:13:03:
我是说不加样品的对称板放反了，反了也没什么了，并不妨碍电路，只是也许会漏缓冲液，多加点缓冲液就ok了

没有放反哦，它本来就是这样的，上面也写了这面朝里。
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34楼2010-12-03 13:06:45
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茜茜1986

新虫 (初入文坛)
★
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我怀疑和分离胶缓冲液有关 你看一下你的缓冲液的pH值是否正确，我以前有过类似的经历，发现是缓冲液的pH值的问题，重新配了就好了
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35楼2010-12-03 16:29:27
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aersileng

银虫 (初入文坛)
★
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注意下你的loading buffer，有段时间我的SDS下端不能成线，后面换了loading buffer，解决了
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36楼2010-12-12 15:02:28
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shuaisuo1984

铁虫 (初入文坛)
★
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没问题呢，我的也是弥散的，但是那只是溴酚蓝的弥散，出来的条带还是挺好的，主要是控制好样品浓度。
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37楼2010-12-14 11:08:08
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tea_gl9871

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by shyuyafeng at 2010-11-16 21:09:03:
恩，我觉得主要的问题是，我的样品和buffer融合之后加热到100度这个时间有点短，平时都是3min中，这次我延长到了8分钟，这样使蛋白质和SDS充分结合，然后在上样之前我又离心了一遍，2min，最后跑的条带就很好， ...

能不能解释一下为什么要把样品和buffer混合后加热100度8分钟？
还有你的样品最终定量到多大浓度？每孔上样多少？能否把你现在的protocol给我发一份，我也在做SDS-PAGE。希望得到你的指点，谢谢！！
我的邮箱tea_gl@126.com
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38楼2011-12-12 08:58:04
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还好吧DJ

新虫 (初入文坛)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我今天也遇到了这个情况，将蛋白稀释了一下，就好了。看了前辈们的东西，收获很大！！
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39楼2014-10-05 14:32:07
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