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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求教蛋白高手
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hflf

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求教蛋白高手 已有3人参与

这几天在摆弄全抗表达，由于没有经验第一次表达时，做的SDS-PAGE胶并且用的也是变性的上样缓冲液，煮过之后上样SDS-PAGE电泳并western blot检测，结果只显示了重链大小的条带，师兄们说是变性使轻重链解开了，这个抗体只检测到重链没有检测到轻链，应该跑非变性胶，所有的缓冲液都是不能加SDS和巯基乙醇。

按照师兄的提示做了非变性电泳及检测并用上次的样做了对照，可是结果挺奇怪了，貌似全抗大小的片段出现了，而上次的对照却没有条带出现。

高手帮忙解释一下，还有个问题求教：我有轻重链DNA知道其序列，分别克隆到载体上表达后形成全抗，怎么计算其全抗的大小及其pI
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行到水穷处，坐看云起时！
1楼 2010-10-15 14:49:57
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hflf

金虫 (小有名气)
高手都去哪儿了，还是我说的不清楚？
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行到水穷处，坐看云起时！
2楼2010-10-18 16:24:25
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meisme.2006

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你好，能否加我QQ交流下，我想请教你个问题，好吗
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3楼2010-10-18 17:37:01
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+2):谢谢交流 2010-10-18 21:39:09
翻译成氨基酸序列，利用DNAman 分力量和等电点可以一次算出来

貌似我在木虫中已不只一次介绍过具体做法了。搜搜以前的回帖吧。
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4楼2010-10-18 18:59:48
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):热心虫友。 2010-10-18 20:52:04
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2431408&fpage=0&view=&highlight=&page=2

20?
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5楼2010-10-18 20:44:48
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hflf

金虫 (小有名气)
非常感谢！！！
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行到水穷处，坐看云起时！
6楼2010-10-18 21:23:21
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
还想请教一下，全抗是由两条轻链和两条重链组成的，我的重轻链是在两个不同的载体上表达的，共转染细胞，表达后形成全抗，那我就单纯地把重链和轻链的分子量/pI加和么，还是有什么具体的公式么？


分子量和等电点单纯的加和都是不准确的。
抗体轻重链之间有二硫键连接，不加还原剂的情况下单纯的sds不能打开（我是这样认为的）这样在进行SDS-PAGE的时候蛋白的空间结构会影响表观的分子量，你无法判断。   如果进行native电泳，除非你有已知分子量的蛋白作为marker，否则很难去判断大小。

pI的确定一般对于单个蛋白的预测相对准确一些，对于复合物的预测不太靠谱，只能参考一下吧。想要精确的需要等点聚焦。  没有pI你还想做native电泳就多看看文献，了解一下类似蛋白的pI，然后确定使用酸性native还是碱性native。
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7楼2010-10-19 10:33:59
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hflf

金虫 (小有名气)
多谢啊
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行到水穷处，坐看云起时！
8楼2010-10-19 15:42:45
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