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【求助/交流】求教蛋白高手 已有3人参与
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这几天在摆弄全抗表达，由于没有经验第一次表达时，做的SDS-PAGE胶并且用的也是变性的上样缓冲液，煮过之后上样SDS-PAGE电泳并western blot检测，结果只显示了重链大小的条带，师兄们说是变性使轻重链解开了，这个抗体只检测到重链没有检测到轻链，应该跑非变性胶，所有的缓冲液都是不能加SDS和巯基乙醇。 按照师兄的提示做了非变性电泳及检测并用上次的样做了对照，可是结果挺奇怪了，貌似全抗大小的片段出现了，而上次的对照却没有条带出现。 高手帮忙解释一下，还有个问题求教：我有轻重链DNA知道其序列，分别克隆到载体上表达后形成全抗，怎么计算其全抗的大小及其pI |
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2楼2010-10-18 16:24:25
3楼2010-10-18 17:37:01
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还想请教一下，全抗是由两条轻链和两条重链组成的，我的重轻链是在两个不同的载体上表达的，共转染细胞，表达后形成全抗，那我就单纯地把重链和轻链的分子量/pI加和么，还是有什么具体的公式么？ 分子量和等电点单纯的加和都是不准确的。 抗体轻重链之间有二硫键连接，不加还原剂的情况下单纯的sds不能打开（我是这样认为的）这样在进行SDS-PAGE的时候蛋白的空间结构会影响表观的分子量，你无法判断。 如果进行native电泳，除非你有已知分子量的蛋白作为marker，否则很难去判断大小。 pI的确定一般对于单个蛋白的预测相对准确一些，对于复合物的预测不太靠谱，只能参考一下吧。想要精确的需要等点聚焦。 没有pI你还想做native电泳就多看看文献，了解一下类似蛋白的pI，然后确定使用酸性native还是碱性native。 |
7楼2010-10-19 10:33:59
8楼2010-10-19 15:42:45
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