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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求教过柱后，酶标仪的使用和酶标板，SDS-PAGE染色
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nmgdwg

银虫 (小有名气)

[求助] 求教过柱后，酶标仪的使用和酶标板，SDS-PAGE染色

小虫第一次做蛋白提纯，又没人带，一路坎坷，最近准备过柱了，有许多不明白，请教各路高手。
1.过柱后所有的流穿液和洗脱液，怎么收集，每1mL收集到一个离心管中吗？
2.确定蛋白的洗脱峰，怎么做？（将收集到的每mL样品，用酶标仪测OD ，再用软件做曲线吗？）
3.如果是用酶标仪测定样品的OD ，用多少nm的光源，用多少孔德酶标板，酶标板的工作体积是多少？
在此先感谢帮助小虫的各路达人了！！！
SDS-PAGE电泳后的 胶片，染色时，胶片还没缩小，脱色后，缩小了30%左右
而且蛋白条带不清楚，底色较重，请大家帮忙分析下
染色液：2.5g R-250 500mL甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水
脱色液：500mL甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水
染色：100mL染色4H
脱色：2片胶 500mL 过夜
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1楼 2011-09-27 11:14:10
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
没做过，帮顶下
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2楼2011-09-27 14:05:05
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-09-27 14:05:05:
没做过，帮顶下

谢谢，版主~请教蛋白过完柱子后，要怎么做呢，怎么才能知道那个是你要的东西啊？
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3楼2011-09-27 16:09:35
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eileen8519

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助。 2011-09-27 20:07:28
nmgdwg(金币+5): 2011-09-28 09:29:36
SDS-PAGE电泳
染色液：1g R-250，450ml乙醇，100ml冰醋酸，450ml水
染色15分钟就可以了，脱色直接用纯水，微波炉加热5min，效果挺好的，条带也清楚。不用像楼主那样染色4h，过夜脱色，很浪费时间。
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4楼2011-09-27 16:52:06
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by eileen8519 at 2011-09-27 16:52:06:
SDS-PAGE电泳
染色液：1g R-250，450ml乙醇，100ml冰醋酸，450ml水
染色15分钟就可以了，脱色直接用纯水，微波炉加热5min，效果挺好的，条带也清楚。不用像楼主那样染色4h，过夜脱色，很浪费时间。

感谢4楼，明试试去，染色脱色都要微波加热5MIN吗？
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5楼2011-09-27 18:40:33
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eileen8519

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-28 07:23:46
引用回帖:
5楼: Originally posted by nmgdwg at 2011-09-27 18:40:33:
感谢4楼，明试试去，染色脱色都要微波加热5MIN吗？

染色不需要加热，加入少许染色液，把胶淹没就可以，然后放在摇床上震荡，这样染色均匀快速，差不多15min。脱色的时候，把染液倒掉，用纯水多冲洗几次，然后到加入一定量的纯水，比染液多一倍，反正也是淹没胶为止，大概小功率微波炉加热5min就可以了，如果脱色不完全，你换一次纯净水再加热2min，效果挺好的。
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6楼2011-09-27 21:55:55
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by eileen8519 at 2011-09-27 21:55:55:
染色不需要加热，加入少许染色液，把胶淹没就可以，然后放在摇床上震荡，这样染色均匀快速，差不多15min。脱色的时候，把染液倒掉，用纯水多冲洗几次，然后到加入一定量的纯水，比染液多一倍，反正也是淹没胶为止 ...

马上去试！
之前买过公司的快速考马斯亮蓝染色液，每步都是加热3-5MIN，但那个染色效果不是很好
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7楼2011-09-28 08:40:15
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yxwb-234

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
nmgdwg(金币+5): 2011-09-28 09:29:51
wanhscn(金币+3): Good！欢迎常来分子生物版！ 2011-09-28 10:18:20
第一个问题，如果连仪器连着电脑，可以在电脑上面看到峰值，如果没有，下面放一自动收集器，过一段时间去测一下，用OD280，如果OD＞1，开始收集。
第二个问题，如果没有连电脑，只能那么做了，收集一管测一管，麻烦。把峰值的单独流出来，加入千分之一还是万分之一浓度（忘了）的硫柳汞，负40或者80度保存。
第三个问题，看你一次测多少，酶标板的类型多了去了，而且看你酶标仪的型号，有的仪器只能测某种规格的酶标板，一般用96孔板。0D490
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8楼2011-09-28 09:01:08
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yxwb-234 at 2011-09-28 09:01:08:
第一个问题，如果连仪器连着电脑，可以在电脑上面看到峰值，如果没有，下面放一自动收集器，过一段时间去测一下，用OD280，如果OD＞1，开始收集。
第二个问题，如果没有连电脑，只能那么做了，收集一管测一管，麻 ...

感谢回复，实验室只有GE 的预装柱，没有任何关于蛋白分离仪器!那只能是:逐份收集流穿液和洗脱液，然后用酶标仪测OD 再做曲线，确定留那几个管子的样品是吗？ 测洗脱液的OD用280还是其他呢？
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9楼2011-09-28 09:14:22
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yxwb-234

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-09-30 07:46:18
nmgdwg(金币+40): 5 2011-09-30 13:27:29
wanhscn(金币+1, MolEPI+1): 根据回帖，授予一个专家指数。欢迎常来分子生物！ 2011-09-30 15:52:42
引用回帖:
9楼: Originally posted by nmgdwg at 2011-09-28 09:14:22:
感谢回复，实验室只有GE 的预装柱，没有任何关于蛋白分离仪器!那只能是:逐份收集流穿液和洗脱液，然后用酶标仪测OD 再做曲线，确定留那几个管子的样品是吗？ 测洗脱液的OD用280还是其他呢？

你用的是多大规格的柱子，亲和层析柱还是分子筛层析？如果小柱子的话，从上样到出峰的时间会短点，第一次你做的时候就估计一下时间，下几次就不用这么瞎计算时间了，刚开始用OD280测，等到洗脱液的OD280大于1的时候，开始收集，然后分别测OD280，OD260，一般用公式，OD280*1.45-OD260*0.74，就是蛋白浓度。
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10楼2011-09-29 21:54:26
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