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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求教过柱后，酶标仪的使用和酶标板，SDS-PAGE染色
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yxwb-234

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-09-30 07:46:18
nmgdwg(金币+40): 5 2011-09-30 13:27:29
wanhscn(金币+1, MolEPI+1): 根据回帖，授予一个专家指数。欢迎常来分子生物！ 2011-09-30 15:52:42
引用回帖:
9楼: Originally posted by nmgdwg at 2011-09-28 09:14:22:
感谢回复，实验室只有GE 的预装柱，没有任何关于蛋白分离仪器!那只能是:逐份收集流穿液和洗脱液，然后用酶标仪测OD 再做曲线，确定留那几个管子的样品是吗？ 测洗脱液的OD用280还是其他呢？

你用的是多大规格的柱子，亲和层析柱还是分子筛层析？如果小柱子的话，从上样到出峰的时间会短点，第一次你做的时候就估计一下时间，下几次就不用这么瞎计算时间了，刚开始用OD280测，等到洗脱液的OD280大于1的时候，开始收集，然后分别测OD280，OD260，一般用公式，OD280*1.45-OD260*0.74，就是蛋白浓度。
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10楼2011-09-29 21:54:26
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【答案】应助回帖

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西瓜(金币+5, MolEPI+1): 不愧是专家，给力啊！ 2011-10-12 11:30:42
1、        HISTRAP affinity columns 是亲和层析柱，楼主想要纯化的蛋白质是不是重组蛋白质？
2、        柱床体积只有1ml实在是太小了，收集管不应该收集1ml那么多，应该收集0.5ml，才会更加能避免蛋白质交叉污染。
3、        由于没有纯化仪或者自动收集仪，所以洗脱梯度只能是不连续线性梯度，建议每个梯度润洗柱床体积5倍以上，就是5-10ml，以便尽可能多的去除杂质蛋白质。
4、        手动收集，不要看任何的A280或者A260，因为蛋白质的量大并不表明纯度高，这一点要切记，且不要漏掉任何洗脱液组分。如果是酶，则将有酶活力的收集组分跑电泳，如果不是酶，则每个组分都要跑电泳看纯度，方可保证万无一失，因为有可能某个组分蛋白质量少，但是纯度极高。凝胶的数量也不算多，8块足够有余了。
5、        脱色的时候凝胶的体积是否变化与脱色液成分有关，你的脱色液里有机物含量过高，导致凝胶脱水，所以会变小。你做一个甲醇含量梯度，例如每升含100、200、300、400、500毫升，醋酸含量不变，最终会找到一个梯度，脱色之后凝胶体积完全不变。
6、        没必要脱色过夜，假如你加大醋酸用量到200毫升每升，一小时换一次，只要3次就能脱色很好了。你染色时间太长，半小时足矣，甚至10分钟都行，你就染色半小时吧。什么加热的都是浮云，没必要搞那么麻烦。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
15楼2011-10-10 22:20:24
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