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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求教过柱后，酶标仪的使用和酶标板，SDS-PAGE染色
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nmgdwg

银虫 (小有名气)

[求助] 求教过柱后，酶标仪的使用和酶标板，SDS-PAGE染色

小虫第一次做蛋白提纯，又没人带，一路坎坷，最近准备过柱了，有许多不明白，请教各路高手。
1.过柱后所有的流穿液和洗脱液，怎么收集，每1mL收集到一个离心管中吗？
2.确定蛋白的洗脱峰，怎么做？（将收集到的每mL样品，用酶标仪测OD ，再用软件做曲线吗？）
3.如果是用酶标仪测定样品的OD ，用多少nm的光源，用多少孔德酶标板，酶标板的工作体积是多少？
在此先感谢帮助小虫的各路达人了！！！
SDS-PAGE电泳后的 胶片，染色时，胶片还没缩小，脱色后，缩小了30%左右
而且蛋白条带不清楚，底色较重，请大家帮忙分析下
染色液：2.5g R-250 500mL甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水
脱色液：500mL甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水
染色：100mL染色4H
脱色：2片胶 500mL 过夜
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1楼 2011-09-27 11:14:10
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 不愧是专家，给力啊！ 2011-10-12 11:30:42
1、        HISTRAP affinity columns 是亲和层析柱，楼主想要纯化的蛋白质是不是重组蛋白质？
2、        柱床体积只有1ml实在是太小了，收集管不应该收集1ml那么多，应该收集0.5ml，才会更加能避免蛋白质交叉污染。
3、        由于没有纯化仪或者自动收集仪，所以洗脱梯度只能是不连续线性梯度，建议每个梯度润洗柱床体积5倍以上，就是5-10ml，以便尽可能多的去除杂质蛋白质。
4、        手动收集，不要看任何的A280或者A260，因为蛋白质的量大并不表明纯度高，这一点要切记，且不要漏掉任何洗脱液组分。如果是酶，则将有酶活力的收集组分跑电泳，如果不是酶，则每个组分都要跑电泳看纯度，方可保证万无一失，因为有可能某个组分蛋白质量少，但是纯度极高。凝胶的数量也不算多，8块足够有余了。
5、        脱色的时候凝胶的体积是否变化与脱色液成分有关，你的脱色液里有机物含量过高，导致凝胶脱水，所以会变小。你做一个甲醇含量梯度，例如每升含100、200、300、400、500毫升，醋酸含量不变，最终会找到一个梯度，脱色之后凝胶体积完全不变。
6、        没必要脱色过夜，假如你加大醋酸用量到200毫升每升，一小时换一次，只要3次就能脱色很好了。你染色时间太长，半小时足矣，甚至10分钟都行，你就染色半小时吧。什么加热的都是浮云，没必要搞那么麻烦。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
15楼2011-10-10 22:20:24
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-09-27 14:05:05:
没做过，帮顶下

谢谢，版主~请教蛋白过完柱子后，要怎么做呢，怎么才能知道那个是你要的东西啊？
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3楼2011-09-27 16:09:35
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eileen8519

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助。 2011-09-27 20:07:28
nmgdwg(金币+5): 2011-09-28 09:29:36
SDS-PAGE电泳
染色液：1g R-250，450ml乙醇，100ml冰醋酸，450ml水
染色15分钟就可以了，脱色直接用纯水，微波炉加热5min，效果挺好的，条带也清楚。不用像楼主那样染色4h，过夜脱色，很浪费时间。
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4楼2011-09-27 16:52:06
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by eileen8519 at 2011-09-27 16:52:06:
SDS-PAGE电泳
染色液：1g R-250，450ml乙醇，100ml冰醋酸，450ml水
染色15分钟就可以了，脱色直接用纯水，微波炉加热5min，效果挺好的，条带也清楚。不用像楼主那样染色4h，过夜脱色，很浪费时间。

感谢4楼，明试试去，染色脱色都要微波加热5MIN吗？
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5楼2011-09-27 18:40:33
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