24小时热门版块排行榜

返回列表

本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

nmgdwg

银虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 410.9
散金: 5
红花: 1
帖子: 114
在线: 44小时
虫号: 1289967
注册: 2011-05-09
专业: 草地科学

[求助] 求教过柱后，酶标仪的使用和酶标板，SDS-PAGE染色

小虫第一次做蛋白提纯，又没人带，一路坎坷，最近准备过柱了，有许多不明白，请教各路高手。
1.过柱后所有的流穿液和洗脱液，怎么收集，每1mL收集到一个离心管中吗？
2.确定蛋白的洗脱峰，怎么做？（将收集到的每mL样品，用酶标仪测OD ，再用软件做曲线吗？）
3.如果是用酶标仪测定样品的OD ，用多少nm的光源，用多少孔德酶标板，酶标板的工作体积是多少？

在此先感谢帮助小虫的各路达人了！！！
SDS-PAGE电泳后的胶片，染色时，胶片还没缩小，脱色后，缩小了30%左右
而且蛋白条带不清楚，底色较重，请大家帮忙分析下
染色液：2.5g R-250 500mL甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水
脱色液：500mL甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水
染色：100mL染色4H
脱色：2片胶 500mL 过夜

回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

Biological

学习园地

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

求教两个物化概念的问题已经有19人回复
过柱子极性太大用甲醇都淋不下来怎么办？？？已经有17人回复
求agilent的保护柱价格已经有3人回复
非英语国家工作语言为英语的语言证明模板已经有11人回复
同工酶的染色及条带判定已经有5人回复
酶标仪测BSA浓度的方法，不用ELISA法，能经过280nm测量吗？已经有10人回复
没用过酶标仪呢，请问96孔板一般要加多少样品量啊已经有13人回复
酶标仪做生理指标如POD、SOD来测定其OD值已经有14人回复
酶标仪的使用已经有15人回复
用过酶标仪的大侠请进来已经有13人回复
（高悬赏求教）SDS-PAGE时间过长,速度慢已经有5人回复
有了解流式细胞仪和酶标仪的么？求助啦~~~ 已经有7人回复
SDS-PAGE电泳，菌液总蛋白，染色后显示的是弥散的已经有5人回复
酶标仪检测的OD值在多少最准已经有15人回复

1楼 2011-09-27 11:14:10

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

专家经验: +248
MolEPI: 46
应助: 257 (大学生)
贵宾: 0.272
金币: 19284.6
散金: 1704
红花: 121
帖子: 6565
在线: 2766.2小时
虫号: 856414
注册: 2009-09-25
性别: GG
专业: 环境微生物学
管辖: 微生物

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 不愧是专家，给力啊！ 2011-10-12 11:30:42

1、 HISTRAP affinity columns 是亲和层析柱，楼主想要纯化的蛋白质是不是重组蛋白质？
2、柱床体积只有1ml实在是太小了，收集管不应该收集1ml那么多，应该收集0.5ml，才会更加能避免蛋白质交叉污染。
3、由于没有纯化仪或者自动收集仪，所以洗脱梯度只能是不连续线性梯度，建议每个梯度润洗柱床体积5倍以上，就是5-10ml，以便尽可能多的去除杂质蛋白质。
4、手动收集，不要看任何的A280或者A260，因为蛋白质的量大并不表明纯度高，这一点要切记，且不要漏掉任何洗脱液组分。如果是酶，则将有酶活力的收集组分跑电泳，如果不是酶，则每个组分都要跑电泳看纯度，方可保证万无一失，因为有可能某个组分蛋白质量少，但是纯度极高。凝胶的数量也不算多，8块足够有余了。
5、脱色的时候凝胶的体积是否变化与脱色液成分有关，你的脱色液里有机物含量过高，导致凝胶脱水，所以会变小。你做一个甲醇含量梯度，例如每升含100、200、300、400、500毫升，醋酸含量不变，最终会找到一个梯度，脱色之后凝胶体积完全不变。
6、没必要脱色过夜，假如你加大醋酸用量到200毫升每升，一小时换一次，只要3次就能脱色很好了。你染色时间太长，半小时足矣，甚至10分钟都行，你就染色半小时吧。什么加热的都是浮云，没必要搞那么麻烦。