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nmgdwg

银虫 (小有名气)

[求助] 求教过柱后，酶标仪的使用和酶标板，SDS-PAGE染色

小虫第一次做蛋白提纯，又没人带，一路坎坷，最近准备过柱了，有许多不明白，请教各路高手。
1.过柱后所有的流穿液和洗脱液，怎么收集，每1mL收集到一个离心管中吗？
2.确定蛋白的洗脱峰，怎么做？（将收集到的每mL样品，用酶标仪测OD ，再用软件做曲线吗？）
3.如果是用酶标仪测定样品的OD ，用多少nm的光源，用多少孔德酶标板，酶标板的工作体积是多少？
在此先感谢帮助小虫的各路达人了！！！
SDS-PAGE电泳后的 胶片，染色时，胶片还没缩小，脱色后，缩小了30%左右
而且蛋白条带不清楚，底色较重，请大家帮忙分析下
染色液：2.5g R-250 500mL甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水
脱色液：500mL甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水
染色：100mL染色4H
脱色：2片胶 500mL 过夜
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1楼 2011-09-27 11:14:10
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yxwb-234 at 2011-09-28 09:01:08:
第一个问题，如果连仪器连着电脑，可以在电脑上面看到峰值，如果没有，下面放一自动收集器，过一段时间去测一下，用OD280，如果OD＞1，开始收集。
第二个问题，如果没有连电脑，只能那么做了，收集一管测一管，麻 ...

感谢回复，实验室只有GE 的预装柱，没有任何关于蛋白分离仪器!那只能是:逐份收集流穿液和洗脱液，然后用酶标仪测OD 再做曲线，确定留那几个管子的样品是吗？ 测洗脱液的OD用280还是其他呢？
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9楼2011-09-28 09:14:22
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-09-27 14:05:05:
没做过，帮顶下

谢谢，版主~请教蛋白过完柱子后，要怎么做呢，怎么才能知道那个是你要的东西啊？
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3楼2011-09-27 16:09:35
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eileen8519

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助。 2011-09-27 20:07:28
nmgdwg(金币+5): 2011-09-28 09:29:36
SDS-PAGE电泳
染色液：1g R-250，450ml乙醇，100ml冰醋酸，450ml水
染色15分钟就可以了，脱色直接用纯水，微波炉加热5min，效果挺好的，条带也清楚。不用像楼主那样染色4h，过夜脱色，很浪费时间。
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4楼2011-09-27 16:52:06
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by eileen8519 at 2011-09-27 16:52:06:
SDS-PAGE电泳
染色液：1g R-250，450ml乙醇，100ml冰醋酸，450ml水
染色15分钟就可以了，脱色直接用纯水，微波炉加热5min，效果挺好的，条带也清楚。不用像楼主那样染色4h，过夜脱色，很浪费时间。

感谢4楼，明试试去，染色脱色都要微波加热5MIN吗？
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5楼2011-09-27 18:40:33
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