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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求教过柱后，酶标仪的使用和酶标板，SDS-PAGE染色
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by yxwb-234 at 2011-09-29 21:54:26:
你用的是多大规格的柱子，亲和层析柱还是分子筛层析？如果小柱子的话，从上样到出峰的时间会短点，第一次你做的时候就估计一下时间，下几次就不用这么瞎计算时间了，刚开始用OD280测，等到洗脱液的OD280大于1的时 ...

十一回来咱们细聊啊~ 假期愉快
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11楼2011-09-30 13:27:58
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
大家国庆假期玩得还好吧！
又要开始做实验了...还得继续向高手们讨教！
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12楼2011-10-09 10:09:12
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yxwb-234 at 2011-09-29 21:54:26:
你用的是多大规格的柱子，亲和层析柱还是分子筛层析？如果小柱子的话，从上样到出峰的时间会短点，第一次你做的时候就估计一下时间，下几次就不用这么瞎计算时间了，刚开始用OD280测，等到洗脱液的OD280大于1的时 ...

GE ，HISTRAP affinity columns 1 mL
那怎么确定哪些是我的目的蛋白，哪些是杂蛋白呢
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13楼2011-10-09 10:12:39
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by nmgdwg at 2011-09-27 16:09:35:
谢谢，版主~请教蛋白过完柱子后，要怎么做呢，怎么才能知道那个是你要的东西啊？

咳咳，我要懂就直接回帖啦……
权当再次帮顶
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14楼2011-10-10 17:27:29
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 不愧是专家，给力啊！ 2011-10-12 11:30:42
1、        HISTRAP affinity columns 是亲和层析柱，楼主想要纯化的蛋白质是不是重组蛋白质？
2、        柱床体积只有1ml实在是太小了，收集管不应该收集1ml那么多，应该收集0.5ml，才会更加能避免蛋白质交叉污染。
3、        由于没有纯化仪或者自动收集仪，所以洗脱梯度只能是不连续线性梯度，建议每个梯度润洗柱床体积5倍以上，就是5-10ml，以便尽可能多的去除杂质蛋白质。
4、        手动收集，不要看任何的A280或者A260，因为蛋白质的量大并不表明纯度高，这一点要切记，且不要漏掉任何洗脱液组分。如果是酶，则将有酶活力的收集组分跑电泳，如果不是酶，则每个组分都要跑电泳看纯度，方可保证万无一失，因为有可能某个组分蛋白质量少，但是纯度极高。凝胶的数量也不算多，8块足够有余了。
5、        脱色的时候凝胶的体积是否变化与脱色液成分有关，你的脱色液里有机物含量过高，导致凝胶脱水，所以会变小。你做一个甲醇含量梯度，例如每升含100、200、300、400、500毫升，醋酸含量不变，最终会找到一个梯度，脱色之后凝胶体积完全不变。
6、        没必要脱色过夜，假如你加大醋酸用量到200毫升每升，一小时换一次，只要3次就能脱色很好了。你染色时间太长，半小时足矣，甚至10分钟都行，你就染色半小时吧。什么加热的都是浮云，没必要搞那么麻烦。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
15楼2011-10-10 22:20:24
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-10-10 17:27:29:
咳咳，我要懂就直接回帖啦……
权当再次帮顶

再次感谢啦！
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16楼2011-10-12 08:35:55
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银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-10-10 22:20:24:
1、        HISTRAP affinity columns 是亲和层析柱，楼主想要纯化的蛋白质是不是重组蛋白质？
2、        柱床体积只有1ml实在是太小了，收集管不应该收集1ml那么多，应该收集0.5ml，才会更加能避免蛋白质交叉污染。
3、        由于 ...

1、那 start buffer  wash buffer  是要全部收集在一起，还是0.5mL /份收集呢？还是就不容收集，直接扔了。我的蛋白不是酶，只能挨个跑电泳了= =
感谢！
这两天就准备过柱子了，加油
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17楼2011-10-12 08:44:59
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
分组分，免得蛋白质交叉了
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18楼2011-10-12 20:01:30
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-10-12 20:01:30:
分组分，免得蛋白质交叉了

蛋白大部分在超离后的沉淀里，无比郁闷
每个梯度都有洗脱下来的蛋白，500mM咪唑条件下，较多，但跟沉淀里的量简直没法比
沉淀的条带有1cm 宽，那个蓝呐。洗脱的条带也就0.5mm 颜色还非常的浅

培养过程：37℃  50mL LB 200rpm震荡8H
100mM IPTG 18℃ 200rpm 震荡14H
高压均质 12000  打2遍
38000超离1H
它咋就沉淀了呢~师姐之前在国外做是可溶的啊 = = 无比纠结
再次麻烦高手了
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19楼2011-10-14 13:07:17
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
目的蛋白质够用就行，具体细节跟你师姐详细交流。
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20楼2011-10-14 22:23:08
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