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nmgdwg

银虫 (小有名气)

[求助] 求教过柱后,酶标仪的使用和酶标板,SDS-PAGE染色

小虫第一次做蛋白提纯,又没人带,一路坎坷,最近准备过柱了,有许多不明白,请教各路高手。
1.过柱后所有的流穿液和洗脱液,怎么收集,每1mL收集到一个离心管中吗?
2.确定蛋白的洗脱峰,怎么做?(将收集到的每mL样品,用酶标仪测OD ,再用软件做曲线吗?)
3.如果是用酶标仪测定样品的OD ,用多少nm的光源,用多少孔德酶标板,酶标板的工作体积是多少?
在此先感谢帮助小虫的各路达人了!!!
SDS-PAGE电泳后的 胶片,染色时,胶片还没缩小,脱色后,缩小了30%左右
而且蛋白条带不清楚,底色较重,请大家帮忙分析下
染色液:2.5g R-250 500mL甲醇,100mL冰醋酸,400mL 水
脱色液:500mL甲醇,100mL冰醋酸,400mL 水
染色:100mL染色4H
脱色:2片胶 500mL 过夜
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nmgdwg

银虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-10-10 22:20:24:
1、        HISTRAP affinity columns 是亲和层析柱,楼主想要纯化的蛋白质是不是重组蛋白质?
2、        柱床体积只有1ml实在是太小了,收集管不应该收集1ml那么多,应该收集0.5ml,才会更加能避免蛋白质交叉污染。
3、        由于 ...

1、那 start buffer  wash buffer  是要全部收集在一起,还是0.5mL /份收集呢?还是就不容收集,直接扔了。我的蛋白不是酶,只能挨个跑电泳了= =
感谢!
这两天就准备过柱子了,加油
17楼2011-10-12 08:44:59
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nmgdwg

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-09-27 14:05:05:
没做过,帮顶下

谢谢,版主~请教蛋白过完柱子后,要怎么做呢,怎么才能知道那个是你要的东西啊?
3楼2011-09-27 16:09:35
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eileen8519

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助。 2011-09-27 20:07:28
nmgdwg(金币+5): 2011-09-28 09:29:36
SDS-PAGE电泳
染色液:1g R-250,450ml乙醇,100ml冰醋酸,450ml水
染色15分钟就可以了,脱色直接用纯水,微波炉加热5min,效果挺好的,条带也清楚。不用像楼主那样染色4h,过夜脱色,很浪费时间。
4楼2011-09-27 16:52:06
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nmgdwg

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by eileen8519 at 2011-09-27 16:52:06:
SDS-PAGE电泳
染色液:1g R-250,450ml乙醇,100ml冰醋酸,450ml水
染色15分钟就可以了,脱色直接用纯水,微波炉加热5min,效果挺好的,条带也清楚。不用像楼主那样染色4h,过夜脱色,很浪费时间。

感谢4楼,明试试去,染色脱色都要微波加热5MIN吗?
5楼2011-09-27 18:40:33
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