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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】重叠延伸pcr第二轮条带较弱，弥散
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hdxudeduo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】重叠延伸pcr第二轮条带较弱，弥散 已有11人参与

最近做重叠延伸点突变，第一轮pcr两个条带都很好，第二轮连接两段，同样的条件，目的带很弱，且整个泳道弥散，我照着目的条带切下回收，想做二次pcr增大产物量，可是怎么也p不出来，模板的量从1/500到5倍都试过了，不行，不知道什么原因。酶和引物都没问题
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1楼 2010-07-25 16:12:20
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
体系变一变，每一次做的时候把条件都换一换~
祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2010-07-25 17:53:46
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tongyanna

金虫 (正式写手)
祝你好运啊
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自己的路，自己快乐的走
3楼2010-07-25 18:21:10
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎交流~~ 2010-07-25 19:59:28
第二次PCR，条带不清晰，要看看是不是你的目的了，看看是不是哪里出了问题，还有你第一次是不是真的P出来了，这些都考虑一下……上面说的对，把能换新的的，都换新的再试试……
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4楼2010-07-25 18:32:46
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
估计你就是没连上，看看引物是不是设计反了？或者重合的bp数太少了
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5楼2010-07-25 19:43:05
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hdxudeduo

银虫 (小有名气)
谢谢各位虫友，我用原来的模板做过对照，p出来的很好
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6楼2010-07-25 21:33:50
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rheliang

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
7楼2011-05-30 15:36:17
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
目的条带淡要不试着增加下循环数，最近也在PCR，很纠结！！！
PCR是魔鬼
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8楼2011-05-30 15:39:01
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ashelychan

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-10-07 18:13:25
我最近也在重叠PCR，不过连第一轮都没P出来。你第二轮P的时候注意退火温度一定不要超过重叠部分的融解温度，要不然重叠部分没办法重叠，这样你也很难扩出来。
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我奋斗，所以我精彩；我快乐，所以我精彩；我自信，所以我精彩
9楼2011-10-07 16:06:53
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hdxudeduo

银虫 (小有名气)
★ ★
wanhscn(金币+2): Good！ 2011-10-08 13:47:17
去年的帖子，现在做个完结。
那时候再怎么改条件，以重叠延伸后的产物做模板都P不出来，但实验得往下走，就直接进行了酶切，和载体进行连接，克隆，还真可以。
开始担心重叠延伸后的产物量少，看来是多余的。
至于重叠延伸PCR的细节经验，我会另辟帖子进行介绍！
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10楼2011-10-08 12:12:56
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