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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于电转酵母X33的问题
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王雨云

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于电转酵母X33的问题已有7人参与

我的表达载体是用的PPICZa，现在电转酵母X33感受态细胞，电压2000v,通电时间3~5ms,但是电转了很多次都得不到阳性转化子。电转的结果要么是不长菌，要么是正常时间里（隔一天长菌）长菌，但是菌落PCR检测全为阴性，不知道还有什么因素会影响电转效率？？（基本可以确定我的感受态效果较好，线性化的产物浓度也很大，每80ul感受态加入10ul线性化产物）
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1楼2010-07-06 18:08:01
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
★
王雨云(金币+1):谢谢参与
王雨云(金币+1): 2010-07-07 07:43:31
貌似你以前咨询过这个问题吧
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2楼2010-07-06 18:20:38
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普通回帖

zemin_fang

木虫 (正式写手)
★
王雨云(金币+1):谢谢参与
王雨云(金币+1): 2010-07-07 07:43:37
你用什么buffer重悬酵母的？是不是电阻太小，导致电流过大？
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3楼2010-07-06 19:46:23
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旋木晴晴

金虫 (小有名气)

妞妞
★
王雨云(金币+1):谢谢参与
楼主怎么确定你的感受态没问题？建议电转后加山梨醇30°保温时间适当延长。
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4楼2010-07-06 20:40:08
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-07-06 18:20:38:
貌似你以前咨询过这个问题吧

以前是不通电，现在是能正常通电了，但是依然转不出来
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5楼2010-07-07 07:42:58
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 旋木晴晴 at 2010-07-06 20:40:08:
楼主怎么确定你的感受态没问题？建议电转后加山梨醇30°保温时间适当延长。

电转空质粒长菌，单独铺YPD+Z平板不长菌。故认为感受态既没污染，而且感受性还可以。30°保温时间一般是2小时。（电转后迅速加入预冷的三梨醇）这些操作都是按一般的方法进行的，还是得不到阳性转化子

[ Last edited by 王雨云 on 2010-7-7 at 14:26 ]
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6楼2010-07-07 07:49:31
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zemin_fang at 2010-07-06 19:46:23:
你用什么buffer重悬酵母的？是不是电阻太小，导致电流过大？

就是1M/L的三梨醇呀，新配的。感受态也是新做的，基本上用到的所有东西都是现配现用的了，就是转不出来，实验室另一个人跟我做的差不多，只是外援基因不一样，他就是一次性电转成功。
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7楼2010-07-07 07:53:11
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旋木晴晴

金虫 (小有名气)

妞妞
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+2):鼓励分享 2010-07-07 18:01:50
引用回帖:
Originally posted by 王雨云 at 2010-07-07 07:49:31:

电转空质粒长菌，单独铺YPD+Z平板不长菌。故认为感受态既没污染，而且感受性还可以。30°保温时间一般是2小时。（电转后迅速加入预冷的三梨醇）这些操作都是按一般的方法进行的，还是得不到阳性转化子

[ La ...

酵母菌落PCR相对细菌比较难一点，楼主P不出也可能是PCR本身的问题。其实已经转成功了。建议菌落PCR时用LITCASE（没有可以用溶菌酶替代）37°处理一小时再反复冻容作为模板。我感觉只要长出来90%都时阳性克隆，以前我是直接培养看有酶活没有，结果都有。好运。
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8楼2010-07-07 17:20:10
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 旋木晴晴 at 2010-07-07 17:20:10:



酵母菌落PCR相对细菌比较难一点，楼主P不出也可能是PCR本身的问题。其实已经转成功了。建议菌落PCR时用LITCASE（没有可以用溶菌酶替代）37°处理一小时再反复冻容作为模板。我感觉只要长出来90%都时阳性克 ...

也听说过这样的方法，而且以前实验室的一师姐还像你说的那样提过酵母总DNA，总是提不出来，不过鉴于目前我的状况还是可以试一下的
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9楼2010-07-09 08:13:46
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jane67788

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问现在问题解决没有？是什么原因呢？我也遇到同样问题，转不出来，求请教。
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10楼2013-04-28 13:52:04
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