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dongfangzz

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于RNA提取后DNaseⅠ的处理 已有8人参与

三个问题:
1、要做Real-time PCR。总RNA提取后,RNA中DNaseⅠ的处理是常规的步骤还是可做可不做?
2、用苯酚/氯仿抽提法去除DNaseⅠ时,有资料说 加入10μl 3M的醋酸钠,250μl 冷乙醇,冰上放置10分钟。该步的冷乙醇是无水乙醇还是70%的乙醇。后面的步骤用的是70%的乙醇(标明的)。而该处没标明浓度,很迷惑!
3、问题2中的 10μl 3M的醋酸钠 ,其中的3M 是什么意思?是浓度吗?但是浓度也不是这么表示的呀?
                                                            
                                                       谢谢

[ Last edited by dongfangzz on 2010-6-4 at 12:20 ]
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yangym1123

木虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
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lstt09nk(金币+3):good 2010-06-04 21:35:13
一般是需要处理RNA中的基因组DNA的,即使电泳看不到DNA的污染,09年的一篇文章给出了荧光定量PCR发SCI论文的要求:MIQE,Google学术搜一下第一篇即是,处理基因组DNA是为了避免基因组污染的一个环节,还有跨内含子设计引物,试剂RTminus的对照;可是使用试剂盒提取RNA(在这个过程除去RNA中的DNA,如Qiagen和天跟的盒子)也可以用Fermentas的DNase I 在反转录之前处理基因组DNA,处理完用EDTA失活后接着往下做反转录就可以(我们实验室以前都是这么做的),关于MIQE的这篇文章建议做荧光定量发SCI的看看!祝你好运!
5楼2010-06-04 21:23:54
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+3):谢谢交流 2010-06-04 13:43:12
1.理论上说RNA中没有基因组DNA污染可不做,建议做。否则残留gDNA影响定量

2.无水乙醇

3. 浓度,3M=3mol/L。M是mol/L的简称
2楼2010-06-04 12:57:25
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cqyniu

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
同意楼上的意见,一直是用M代表浓度的啊M是mol/L
3楼2010-06-04 16:08:19
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-04 17:25:53
总RNA提取后,用RNA做模板,扩一下内参或表达水平高的基因,35个循环,如果无预期的带,则可不做DNaseⅠ处理。
4楼2010-06-04 17:12:58
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