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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于RNA提取后DNaseⅠ的处理
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dongfangzz

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于RNA提取后DNaseⅠ的处理 已有8人参与

三个问题：
1、要做Real-time PCR。总RNA提取后，RNA中DNaseⅠ的处理是常规的步骤还是可做可不做？
2、用苯酚/氯仿抽提法去除DNaseⅠ时，有资料说 加入10μl 3M的醋酸钠，250μl 冷乙醇，冰上放置10分钟。该步的冷乙醇是无水乙醇还是70％的乙醇。后面的步骤用的是70％的乙醇（标明的）。而该处没标明浓度，很迷惑！
3、问题2中的 10μl 3M的醋酸钠 ，其中的3M 是什么意思？是浓度吗？但是浓度也不是这么表示的呀？
                                                            
                                                       谢谢

[ Last edited by dongfangzz on 2010-6-4 at 12:20 ]
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1楼 2010-06-04 12:17:21
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+3):谢谢交流 2010-06-04 13:43:12
1.理论上说RNA中没有基因组DNA污染可不做，建议做。否则残留gDNA影响定量

2.无水乙醇

3. 浓度，3M=3mol/L。M是mol/L的简称
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2楼2010-06-04 12:57:25
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cqyniu

金虫 (小有名气)
★
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同意楼上的意见，一直是用M代表浓度的啊M是mol/L
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3楼2010-06-04 16:08:19
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-04 17:25:53
总RNA提取后，用RNA做模板，扩一下内参或表达水平高的基因，35个循环，如果无预期的带，则可不做DNaseⅠ处理。
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4楼2010-06-04 17:12:58
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yangym1123

木虫 (小有名气)
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lstt09nk(金币+3):good 2010-06-04 21:35:13
一般是需要处理RNA中的基因组DNA的，即使电泳看不到DNA的污染，09年的一篇文章给出了荧光定量PCR发SCI论文的要求：MIQE，Google学术搜一下第一篇即是，处理基因组DNA是为了避免基因组污染的一个环节，还有跨内含子设计引物，试剂RTminus的对照；可是使用试剂盒提取RNA（在这个过程除去RNA中的DNA，如Qiagen和天跟的盒子）也可以用Fermentas的DNase I 在反转录之前处理基因组DNA，处理完用EDTA失活后接着往下做反转录就可以（我们实验室以前都是这么做的），关于MIQE的这篇文章建议做荧光定量发SCI的看看！祝你好运！
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5楼2010-06-04 21:23:54
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dongfangzz

银虫 (小有名气)
谢谢各位热心答复！
想再问下一般常用的去除RNA中的DNA的方法是什么？具体步骤是什么样的?
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6楼2010-06-04 21:42:48
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-06-04 23:19:49
引用回帖:
Originally posted by dongfangzz at 2010-06-04 21:42:48:
谢谢各位热心答复！
想再问下一般常用的去除RNA中的DNA的方法是什么？具体步骤是什么样的?

RNase Free的DNase消化就行了
根据终体积，照着比例加buffer，加上10U左右的DNase，水补齐，37度温育半个小时差不多了
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7楼2010-06-04 21:59:53
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qingsong35

铜虫 (小有名气)
★ ★
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scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-06-08 22:51:18
我们提取RNA后，都要用Dnase I处理后然后过柱纯化，以处理后的RNA未模板进行PCR确定无基因组DNA污染后，才进行real time PCR
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8楼2010-06-08 17:11:48
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dongfangzz

银虫 (小有名气)
那用Dnase处理完DNA后，留在RNA中等Dnase 又怎么除去呢？
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9楼2010-06-09 23:11:06
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ben1147

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by dongfangzz at 2010-06-09 23:11:06:
那用Dnase处理完DNA后，留在RNA中等Dnase 又怎么除去呢？

可以酚氯仿、氯仿抽提、乙醇沉淀之后水溶

也可以用一般的小离心柱（RNase Free）纯化
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10楼2010-06-09 23:14:52
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