应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于克隆连接
51/1返回列表
查看: 1543  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～

[交流] 【求助/交流】关于克隆连接 已有7人参与

本人做的单酶切连接，质粒经过去磷酸化处理，为什么酶切的载体转化后涂板长出很多菌落，去磷酸的质粒加片段却只长出2个菌落。
单酶切载体不加T4酶在体外能自连吗？电泳图觉得自己单酶切的效率还是挺高的。
高手指点，已经无路可走了！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
平和悦衲！
1楼 2010-05-29 10:26:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by haoqian6135 at 2010-05-30 19:15:13:

谢谢哦！不过质粒酶切1微克少吗？回收后是不是就更少了啊？

我一般质粒最多切100 ng，不回收直接连。
赞一下(1人) 回复此楼
Thank-you，so-blue.
8楼2010-05-30 19:48:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

小白兄

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 16:34:49
我前段时间做克隆就出现这种情况。我当时是双酶切，但是酶切掉的片段很小只有100bp左右，就出现跑胶分不开，跑胶看只是一条带，但是里面有很多只切一刀的，连接时会出现载体自连。怎么也筛不出阳性克隆，以为很多因素出问题了，重新做了好几次也还是这样。最后没办法，加了CIAP使载体去磷酸化，连接涂板上的菌落少了很多，这次筛选的基本上都是阳性。你的去磷酸化载体连接片段转化只长两个菌，检验过是阳性吗？可能是你转化效率较低，我们用的是电转，你呢?
赞一下(2人) 回复此楼
时光如流水，匆匆而过。
2楼2010-05-29 10:44:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-30 21:21:19
酶切载体转化后长出很多应该是有一部分没切开。虽然跑电泳看见全部切开了，也不一定保证都切开了（比如还有几十个载体没切开，电泳图片上你看得见质粒条带吗？），你将载体单切回收，再转化看看，应该不会长很多的。
赞一下(2人) 回复此楼
Thank-you，so-blue.
3楼2010-05-30 15:50:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-30 21:21:29
单酶切后不去磷酸化是不行的，连接后会全是自连的，而且磷酸化不彻底也会导致基本上是自连：
1，我一般酶切1μg质粒然后跑胶后回收后溶解在100μl的水中
2，分两管磷酸化，反应半小时后补加CIAP在反应半小时
3，回收后溶解在10μl左右的水中
4，连接20μl体系，加5-6ul载体，片段多加点。。。。
每次转化子不是很多10多个，阳性率挺高的；只要是转化子很多就会基本上是自连。。。。
赞一下(2人) 回复此楼
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-05-30 17:46:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 08工学调剂 +12 用户573181 2026-03-20 17/850 2026-03-24 21:45 by 番茄炖了西红柿
[考研] 0854AI CV方向招收调剂 +3 章小鱼567 2026-03-23 3/150 2026-03-24 20:25 by 汪！？！
[有机交流] 有机合成求助 20+3 FENGSHUJEI 2026-03-23 5/250 2026-03-24 19:31 by 88817753
[考研] 【双一流院校新能源、环境材料，材料加工与模拟招收大量调剂】 +4 Higraduate 2026-03-22 7/350 2026-03-24 11:23 by 种大树
[考研] 279分求调剂 一志愿211 +18 chaojifeixia 2026-03-19 20/1000 2026-03-24 10:34 by dolphin_ycj
[考研] 0703化学求调剂 +4 奶油草莓. 2026-03-22 5/250 2026-03-23 19:37 by pswait
[考研] 一志愿陕师大生物学071000，298分，求调剂 +3 SYA！ 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:09 by macy2011
[考研] 333求调剂 +3 ALULU4408 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:04 by macy2011
[考研] 考研化学308分求调剂 +7 你好明天你好 2026-03-23 8/400 2026-03-23 18:39 by macy2011
[考研] 263求调剂 +6 yqdszhdap－ 2026-03-22 9/450 2026-03-23 12:57 by yqdszhdap－
[考研] 311求调剂 +6 冬十三 2026-03-18 6/300 2026-03-22 20:18 by edmund7
[考研] 286求调剂 +10 Faune 2026-03-21 10/500 2026-03-21 23:34 by 314126402
[考研] 一志愿深大，0703化学，总分302，求调剂 +4 七月-七七 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:20 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂 +3 .m.. 2026-03-21 4/200 2026-03-21 16:25 by barlinike
[考研] 材料学学硕080502 337求调剂-一志愿华中科技大学 +4 顺顺顺mr 2026-03-18 5/250 2026-03-21 10:22 by luoyongfeng
[考研] 22408 344分 求调剂 一志愿 华电计算机技术 +4 solanXXX 2026-03-20 4/200 2026-03-20 23:49 by alg094825
[考研] 295求调剂 +4 一志愿京区211 2026-03-18 6/300 2026-03-20 23:41 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +3 阿姐阿姐家啊 2026-03-18 3/150 2026-03-20 23:24 by JourneyLucky
[考研] 材料学硕297已过四六级求调剂推荐 +11 adaie 2026-03-19 11/550 2026-03-20 21:30 by laoshidan
[考研] 一志愿吉林大学材料学硕321求调剂 +11 Ymlll 2026-03-18 15/750 2026-03-20 19:40 by 丁丁*
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭