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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～

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专业: 生物化学

[交流] 【求助/交流】关于克隆连接已有7人参与

本人做的单酶切连接，质粒经过去磷酸化处理，为什么酶切的载体转化后涂板长出很多菌落，去磷酸的质粒加片段却只长出2个菌落。
单酶切载体不加T4酶在体外能自连吗？电泳图觉得自己单酶切的效率还是挺高的。
高手指点，已经无路可走了！！！

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平和悦衲！

1楼 2010-05-29 10:26:52

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小白兄

金虫 (小有名气)

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专业: 蛋白质组学

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 16:34:49

我前段时间做克隆就出现这种情况。我当时是双酶切，但是酶切掉的片段很小只有100bp左右，就出现跑胶分不开，跑胶看只是一条带，但是里面有很多只切一刀的，连接时会出现载体自连。怎么也筛不出阳性克隆，以为很多因素出问题了，重新做了好几次也还是这样。最后没办法，加了CIAP使载体去磷酸化，连接涂板上的菌落少了很多，这次筛选的基本上都是阳性。你的去磷酸化载体连接片段转化只长两个菌，检验过是阳性吗？可能是你转化效率较低，我们用的是电转，你呢?