| 查看: 1544 | 回复: 15 | |||
haoqian6135木虫 (正式写手)
蜗牛～
|
[交流]
【求助/交流】关于克隆连接 已有7人参与
|
|
本人做的单酶切连接，质粒经过去磷酸化处理，为什么酶切的载体转化后涂板长出很多菌落，去磷酸的质粒加片段却只长出2个菌落。 单酶切载体不加T4酶在体外能自连吗？电泳图觉得自己单酶切的效率还是挺高的。 高手指点，已经无路可走了！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有289人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 基因克隆中酶切连接问题
已经有13人回复
- 求助：请问做TOPO克隆时总是连接不上怎么回事啊？
已经有9人回复
- 分子克隆连接问题！
已经有12人回复
- 关于切胶回收后有质粒污染和拼接PCR涂抹装条带的问题，有点长，呵呵
已经有13人回复
- 克隆基因连接到载体上测序发现有一个点突变怎么办？
已经有16人回复
- 克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？
已经有17人回复
- 【分享】分子克隆实验专题-（二）酶切连接要点探讨
已经有15人回复
- 【求助】TA克隆能用T-easy载体连接4500bp的片段吗
已经有4人回复
- 【求助/交流】克隆连接时间
已经有18人回复
- 【求助/交流】关于平末端连接
已经有25人回复
- 【求助/交流】单酶切连接的克隆急……
已经有10人回复
- 【求助/交流】关于PCR克隆片段连接问题
已经有4人回复
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 16:34:49
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 16:34:49
| 我前段时间做克隆就出现这种情况。我当时是双酶切，但是酶切掉的片段很小只有100bp左右，就出现跑胶分不开，跑胶看只是一条带，但是里面有很多只切一刀的，连接时会出现载体自连。怎么也筛不出阳性克隆，以为很多因素出问题了，重新做了好几次也还是这样。最后没办法，加了CIAP使载体去磷酸化，连接涂板上的菌落少了很多，这次筛选的基本上都是阳性。你的去磷酸化载体连接片段转化只长两个菌，检验过是阳性吗？可能是你转化效率较低，我们用的是电转，你呢? |
2楼2010-05-29 10:44:48
susizheng
木虫 (著名写手)
我們是糖 甜到憂傷
- MolEPI: 10
- 应助: 130 (高中生)
- 贵宾: 0.008
- 金币: 4738.3
- 散金: 2273
- 红花: 56
- 帖子: 2308
- 在线: 740.7小时
- 虫号: 642666
- 注册: 2008-11-01
- 性别: GG
- 专业: 有机合成
3楼2010-05-30 15:50:57
fungixx
至尊木虫 (文坛精英)
- 应助: 37 (小学生)
- 贵宾: 3.458
- 金币: 19627.6
- 散金: 18645
- 红花: 118
- 沙发: 273
- 帖子: 13324
- 在线: 2030.7小时
- 虫号: 860534
- 注册: 2009-09-30
- 专业: 抗肿瘤药物药理
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-30 21:21:29
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-30 21:21:29
|
单酶切后不去磷酸化是不行的，连接后会全是自连的，而且磷酸化不彻底也会导致基本上是自连： 1，我一般酶切1μg质粒然后跑胶后回收后溶解在100μl的水中 2，分两管磷酸化，反应半小时后补加CIAP在反应半小时 3，回收后溶解在10μl左右的水中 4，连接20μl体系，加5-6ul载体，片段多加点。。。。 每次转化子不是很多10多个，阳性率挺高的；只要是转化子很多就会基本上是自连。。。。 |
4楼2010-05-30 17:46:02
5楼2010-05-30 18:21:01
haoqian6135
木虫 (正式写手)
蜗牛～
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1764.2
- 帖子: 435
- 在线: 171小时
- 虫号: 733468
- 注册: 2009-03-28
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
6楼2010-05-30 19:15:13
haoqian6135
木虫 (正式写手)
蜗牛～
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1764.2
- 帖子: 435
- 在线: 171小时
- 虫号: 733468
- 注册: 2009-03-28
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
7楼2010-05-30 19:16:29
susizheng
木虫 (著名写手)
我們是糖 甜到憂傷
- MolEPI: 10
- 应助: 130 (高中生)
- 贵宾: 0.008
- 金币: 4738.3
- 散金: 2273
- 红花: 56
- 帖子: 2308
- 在线: 740.7小时
- 虫号: 642666
- 注册: 2008-11-01
- 性别: GG
- 专业: 有机合成
8楼2010-05-30 19:48:27
ben1147
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 18 (小学生)
- 贵宾: 0.003
- 金币: 5847.6
- 红花: 6
- 帖子: 952
- 在线: 116.9小时
- 虫号: 709538
- 注册: 2009-02-26
- 专业: 微生物生理与生物化学
9楼2010-05-30 22:48:54
10楼2010-05-30 23:05:36
6
