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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于克隆连接
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～

[交流] 【求助/交流】关于克隆连接 已有7人参与

本人做的单酶切连接，质粒经过去磷酸化处理，为什么酶切的载体转化后涂板长出很多菌落，去磷酸的质粒加片段却只长出2个菌落。
单酶切载体不加T4酶在体外能自连吗？电泳图觉得自己单酶切的效率还是挺高的。
高手指点，已经无路可走了！！！
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平和悦衲！
1楼 2010-05-29 10:26:52
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小白兄

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 16:34:49
我前段时间做克隆就出现这种情况。我当时是双酶切，但是酶切掉的片段很小只有100bp左右，就出现跑胶分不开，跑胶看只是一条带，但是里面有很多只切一刀的，连接时会出现载体自连。怎么也筛不出阳性克隆，以为很多因素出问题了，重新做了好几次也还是这样。最后没办法，加了CIAP使载体去磷酸化，连接涂板上的菌落少了很多，这次筛选的基本上都是阳性。你的去磷酸化载体连接片段转化只长两个菌，检验过是阳性吗？可能是你转化效率较低，我们用的是电转，你呢?
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时光如流水，匆匆而过。
2楼2010-05-29 10:44:48
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★
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scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-30 21:21:19
酶切载体转化后长出很多应该是有一部分没切开。虽然跑电泳看见全部切开了，也不一定保证都切开了（比如还有几十个载体没切开，电泳图片上你看得见质粒条带吗？），你将载体单切回收，再转化看看，应该不会长很多的。
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Thank-you，so-blue.
3楼2010-05-30 15:50:57
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
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scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-30 21:21:29
单酶切后不去磷酸化是不行的，连接后会全是自连的，而且磷酸化不彻底也会导致基本上是自连：
1，我一般酶切1μg质粒然后跑胶后回收后溶解在100μl的水中
2，分两管磷酸化，反应半小时后补加CIAP在反应半小时
3，回收后溶解在10μl左右的水中
4，连接20μl体系，加5-6ul载体，片段多加点。。。。
每次转化子不是很多10多个，阳性率挺高的；只要是转化子很多就会基本上是自连。。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-05-30 17:46:02
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sunqx

木虫 (著名写手)
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scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-30 21:21:38
载体去磷酸化，片段不去磷酸化。调整好 载体和片段的比例，只要片段不是很大， 应该很容易就连接上的。
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5楼2010-05-30 18:21:01
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-05-30 15:50:57:
酶切载体转化后长出很多应该是有一部分没切开。虽然跑电泳看见全部切开了，也不一定保证都切开了（比如还有几十个载体没切开，电泳图片上你看得见质粒条带吗？），你将载体单切回收，再转化看看，应该不会长很多的。

谢谢哦！不过质粒酶切1微克少吗？回收后是不是就更少了啊？
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平和悦衲！
6楼2010-05-30 19:15:13
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
引用回帖:
Originally posted by 小白兄 at 2010-05-29 10:44:48:
我前段时间做克隆就出现这种情况。我当时是双酶切，但是酶切掉的片段很小只有100bp左右，就出现跑胶分不开，跑胶看只是一条带，但是里面有很多只切一刀的，连接时会出现载体自连。怎么也筛不出阳性克隆，以为很多 ...

恩，回收后的质粒做了转化，还是有啊！
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平和悦衲！
7楼2010-05-30 19:16:29
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
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引用回帖:
Originally posted by haoqian6135 at 2010-05-30 19:15:13:

谢谢哦！不过质粒酶切1微克少吗？回收后是不是就更少了啊？

我一般质粒最多切100 ng，不回收直接连。
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Thank-you，so-blue.
8楼2010-05-30 19:48:27
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ben1147

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by haoqian6135 at 2010-05-30 19:15:13:

谢谢哦！不过质粒酶切1微克少吗？回收后是不是就更少了啊？

质粒量少的话酶切比较容易切完全，可以不用切胶，直接纯化一下继续用
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9楼2010-05-30 22:48:54
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小白兄

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by haoqian6135 at 2010-05-30 19:16:29:

恩，回收后的质粒做了转化，还是有啊！

有什么？阳性克隆吗？说清楚了还帮你解决。
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时光如流水，匆匆而过。
10楼2010-05-30 23:05:36
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