应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于克隆连接
南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
51/1返回列表
查看: 1267  |  回复: 15
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～

[交流] 【求助/交流】关于克隆连接已有7人参与

本人做的单酶切连接，质粒经过去磷酸化处理，为什么酶切的载体转化后涂板长出很多菌落，去磷酸的质粒加片段却只长出2个菌落。
单酶切载体不加T4酶在体外能自连吗？电泳图觉得自己单酶切的效率还是挺高的。
高手指点，已经无路可走了！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
平和悦衲！
1楼2010-05-29 10:26:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by haoqian6135 at 2010-05-30 19:15:13:

谢谢哦！不过质粒酶切1微克少吗？回收后是不是就更少了啊？

质粒量少的话酶切比较容易切完全，可以不用切胶，直接纯化一下继续用
赞一下 回复此楼
9楼2010-05-30 22:48:54
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

小白兄

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 16:34:49
我前段时间做克隆就出现这种情况。我当时是双酶切，但是酶切掉的片段很小只有100bp左右，就出现跑胶分不开，跑胶看只是一条带，但是里面有很多只切一刀的，连接时会出现载体自连。怎么也筛不出阳性克隆，以为很多因素出问题了，重新做了好几次也还是这样。最后没办法，加了CIAP使载体去磷酸化，连接涂板上的菌落少了很多，这次筛选的基本上都是阳性。你的去磷酸化载体连接片段转化只长两个菌，检验过是阳性吗？可能是你转化效率较低，我们用的是电转，你呢?
赞一下(2人) 回复此楼
时光如流水，匆匆而过。
2楼2010-05-29 10:44:48
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-30 21:21:19
酶切载体转化后长出很多应该是有一部分没切开。虽然跑电泳看见全部切开了，也不一定保证都切开了（比如还有几十个载体没切开，电泳图片上你看得见质粒条带吗？），你将载体单切回收，再转化看看，应该不会长很多的。
赞一下(2人) 回复此楼
Thank-you，so-blue.
3楼2010-05-30 15:50:57
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-30 21:21:29
单酶切后不去磷酸化是不行的，连接后会全是自连的，而且磷酸化不彻底也会导致基本上是自连：
1，我一般酶切1μg质粒然后跑胶后回收后溶解在100μl的水中
2，分两管磷酸化，反应半小时后补加CIAP在反应半小时
3，回收后溶解在10μl左右的水中
4，连接20μl体系，加5-6ul载体，片段多加点。。。。
每次转化子不是很多10多个，阳性率挺高的；只要是转化子很多就会基本上是自连。。。。
赞一下(2人) 回复此楼
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-05-30 17:46:02
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭