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haoqian6135木虫 (正式写手)
蜗牛～
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[交流]
【求助/交流】关于克隆连接 已有7人参与
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本人做的单酶切连接，质粒经过去磷酸化处理，为什么酶切的载体转化后涂板长出很多菌落，去磷酸的质粒加片段却只长出2个菌落。 单酶切载体不加T4酶在体外能自连吗？电泳图觉得自己单酶切的效率还是挺高的。 高手指点，已经无路可走了！！！ |
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fungixx
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scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-30 21:21:29
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单酶切后不去磷酸化是不行的，连接后会全是自连的，而且磷酸化不彻底也会导致基本上是自连： 1，我一般酶切1μg质粒然后跑胶后回收后溶解在100μl的水中 2，分两管磷酸化，反应半小时后补加CIAP在反应半小时 3，回收后溶解在10μl左右的水中 4，连接20μl体系，加5-6ul载体，片段多加点。。。。 每次转化子不是很多10多个，阳性率挺高的；只要是转化子很多就会基本上是自连。。。。 |
4楼2010-05-30 17:46:02
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lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 16:34:49
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| 我前段时间做克隆就出现这种情况。我当时是双酶切，但是酶切掉的片段很小只有100bp左右，就出现跑胶分不开，跑胶看只是一条带，但是里面有很多只切一刀的，连接时会出现载体自连。怎么也筛不出阳性克隆，以为很多因素出问题了，重新做了好几次也还是这样。最后没办法，加了CIAP使载体去磷酸化，连接涂板上的菌落少了很多，这次筛选的基本上都是阳性。你的去磷酸化载体连接片段转化只长两个菌，检验过是阳性吗？可能是你转化效率较低，我们用的是电转，你呢? |
2楼2010-05-29 10:44:48
susizheng
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