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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于克隆连接
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
引用回帖:
Originally posted by 小白兄 at 2010-05-30 23:05:36:

有什么？阳性克隆吗？说清楚了还帮你解决。

做质粒的对照时，没有加片段及T4连接酶，说明我的质粒酶切不完全吗？电泳图看酶切质量还是可以的。
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平和悦衲！
11楼2010-05-31 11:05:43
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小白兄

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by haoqian6135 at 2010-05-31 11:05:43:

做质粒的对照时，没有加片段及T4连接酶，说明我的质粒酶切不完全吗？电泳图看酶切质量还是可以的。

你是指跑胶的时候加质粒做对照了吗？
单切的质粒最终跑胶是在质粒两条带前面，但是开始一段时间是在质粒两条带之间的。
你的酶切完全是指单切只出现一条带？
你回复我中怎么还提到T4连接酶和片段，什么意思，没搞清楚。
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时光如流水，匆匆而过。
12楼2010-05-31 12:15:47
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清水塘

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看了你们的讨论，感觉很有收获，本人也在做这方面的实验。我的质粒载体大小为4Kb多，用XhoI单酶切后，连上一个3Kb的目的基因，试了很多次也没能连上，找出来的菌全是载体自连的。我也进行去磷酸化了，是不是去磷酸化效率太低了呢。
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13楼2010-05-31 18:48:19
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
引用回帖:
Originally posted by haoqian6135 at 2010-05-31 11:05:43:

做质粒的对照时，没有加片段及T4连接酶，说明我的质粒酶切不完全吗？电泳图看酶切质量还是可以的。

非常感谢喽！实验出来了！
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平和悦衲！
14楼2010-06-01 18:59:12
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
引用回帖:
Originally posted by 小白兄 at 2010-05-31 12:15:47:

你是指跑胶的时候加质粒做对照了吗？
单切的质粒最终跑胶是在质粒两条带前面，但是开始一段时间是在质粒两条带之间的。
你的酶切完全是指单切只出现一条带？
你回复我中怎么还提到T4连接酶和片段，什么意思， ...

去磷酸化同时也是降低了质粒的回收率，建议做一个质粒去磷酸的做一个质粒未去磷酸的。
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平和悦衲！
15楼2010-06-01 19:00:29
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小白兄

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by haoqian6135 at 2010-06-01 19:00:29:

去磷酸化同时也是降低了质粒的回收率，建议做一个质粒去磷酸的做一个质粒未去磷酸的。

楼主引贴引错了吧？看到我好晕，是谢我吗？
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时光如流水，匆匆而过。
16楼2010-06-01 22:57:49
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