| 查看: 1576 | 回复: 15 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
haoqian6135木虫 (正式写手)
蜗牛～
|
[交流]
【求助/交流】关于克隆连接 已有7人参与
|
||
|
本人做的单酶切连接，质粒经过去磷酸化处理，为什么酶切的载体转化后涂板长出很多菌落，去磷酸的质粒加片段却只长出2个菌落。 单酶切载体不加T4酶在体外能自连吗？电泳图觉得自己单酶切的效率还是挺高的。 高手指点，已经无路可走了！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有132人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
化工申博
已经有3人回复
-
申博自荐
已经有3人回复
-
广西民族大学化学化工学院化学工程与技术学硕，材料化工专硕调剂名额充足！
已经有0人回复
清水塘
木虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 2302.2
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 235
- 在线: 277.8小时
- 虫号: 940753
- 注册: 2010-01-11
- 性别: GG
- 专业: 色谱分析
13楼2010-05-31 18:48:19
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 16:34:49
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 16:34:49
| 我前段时间做克隆就出现这种情况。我当时是双酶切，但是酶切掉的片段很小只有100bp左右，就出现跑胶分不开，跑胶看只是一条带，但是里面有很多只切一刀的，连接时会出现载体自连。怎么也筛不出阳性克隆，以为很多因素出问题了，重新做了好几次也还是这样。最后没办法，加了CIAP使载体去磷酸化，连接涂板上的菌落少了很多，这次筛选的基本上都是阳性。你的去磷酸化载体连接片段转化只长两个菌，检验过是阳性吗？可能是你转化效率较低，我们用的是电转，你呢? |
2楼2010-05-29 10:44:48
susizheng
木虫 (著名写手)
我們是糖 甜到憂傷
- MolEPI: 10
- 应助: 130 (高中生)
- 贵宾: 0.008
- 金币: 4738.3
- 散金: 2273
- 红花: 56
- 帖子: 2308
- 在线: 740.7小时
- 虫号: 642666
- 注册: 2008-11-01
- 性别: GG
- 专业: 有机合成
3楼2010-05-30 15:50:57
fungixx
至尊木虫 (文坛精英)
- 应助: 37 (小学生)
- 贵宾: 3.458
- 金币: 19627.6
- 散金: 18645
- 红花: 118
- 沙发: 273
- 帖子: 13324
- 在线: 2030.7小时
- 虫号: 860534
- 注册: 2009-09-30
- 专业: 抗肿瘤药物药理
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-30 21:21:29
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-30 21:21:29
|
单酶切后不去磷酸化是不行的，连接后会全是自连的，而且磷酸化不彻底也会导致基本上是自连： 1，我一般酶切1μg质粒然后跑胶后回收后溶解在100μl的水中 2，分两管磷酸化，反应半小时后补加CIAP在反应半小时 3，回收后溶解在10μl左右的水中 4，连接20μl体系，加5-6ul载体，片段多加点。。。。 每次转化子不是很多10多个，阳性率挺高的；只要是转化子很多就会基本上是自连。。。。 |
4楼2010-05-30 17:46:02
