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feitianrenwo

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】求助基因克隆方面的问题解决方案 已有10人参与

求助基因克隆方面的问题解决方案

本人正在克隆一个微生物的一个基因,设计简并引物扩增基因组DNA,获得了几个DNA片段,在NCBI里比对,与一些微生物的同源性达到80%以上,我想知道有了这些DNA片段的序列,如何知道相应的氨基酸序列呢?然后如何得到该基因的全长?(已经知道没有内含子)
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lingn

木虫 (正式写手)


feitianrenwo(金币+1):谢谢参与
feitianrenwo(金币+1): 2010-05-16 09:44:15
做RACE吧,如果转录本的量还比较大的话,
好的反转录试剂盒+好的PCR酶
9楼2010-05-15 19:49:39
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gastrodia

金虫 (正式写手)

★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-14 21:16:19
feitianrenwo(金币+3): 2010-05-15 09:44:05
feitianrenwo(金币+1): 2010-05-16 09:44:38
有了DNA序列如何知道相应的aa氨基酸序列?翻译啊,无论是什么序列,只要是功能基因,那么只有一个阅读框是正确的,你可以正向反向翻译,去掉一个碱基再翻译,去掉两个碱基再翻译,在翻译中不中断的序列即是正确的阅读框,拿翻译的结果去做蛋白质blast
2楼2010-05-14 19:57:24
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-14 21:16:28
feitianrenwo(金币+3): 2010-05-15 09:44:14
feitianrenwo(金币+1): 2010-05-16 09:44:35
首先楼主要说明白,获得的片段是从头到尾的,还是只是一部分,就是说楼主要说明白引物是怎么设计的,在什么位置设计的,明确这一点的目的是要知道是否包含完整的阅读框。

如果楼主PCR所用引物比较靠近两端,就是说基本能包含完整的阅读框,那么直接使用NCBI的ORF fineder就可以了,可以直接找到整个开放阅读框,并且翻译出氨基酸序列,包含起始密码子和终止密码子
3楼2010-05-14 20:39:21
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feitianrenwo

木虫 (著名写手)

我是根据保守的氨基酸序列设计的简并引物,对基因组DNA扩增获得了一些片段,但是经ORF的finder搜索并没有发现开放阅读框。

我的意思是如何通过这些DNA的序列知道相应的氨基酸序列,然后就是通过什么方法获得基因的全长
4楼2010-05-15 09:52:57
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