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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
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zhy19850501

[交流] 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因 已有14人参与

大家好，我构建表达载体连接PET-28A，已经连接多次但都失败，感受态细胞也换了几次，鉴定全是假阳性，这可能是什么原因呢，希望大家多多帮忙！
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1楼 2010-05-08 14:27:43
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
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1。提取过质粒吗，是空载体吗，会不会是某种酶没有切开啊，或者是片段或者是质粒。连接时片段的量一定要远高于载体的片段，至少片段：载体>3吧
2。感受态可能没有问题，毕竟有菌长起来，要是验证感受态的话，可以转点质粒看看。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-05-08 14:44:43
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zhy19850501

我的目的片段浓度可能比较低，但不至于一点都连不上吧，我提的质粒确实是空载。
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3楼2010-05-08 15:09:49
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
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lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-08 18:50:34
你用的是蓝白筛选吗？如果是蓝白筛选，那么选的白斑就绝对不是空载，而是连接的片段太小，你没有看到而已，所以我有可能是质粒污染。但是污染也不可能没有阳性，那你没有阳性，很有可能还是连接的问题，没有连上是最大的原因。你连接的片段是PCR产物，还是胶回收产物，还是其他什么片段，浓度怎么样，长度多大
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4楼2010-05-08 15:22:25
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
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要完全避免空载体，你就把载体双酶切做空连对照再做吧。载体自连没有长起来就可以了，如果长得很多，那你的酶切有问题。
双酶切有问题你就单酶切。
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生物资源交流QQ群：1044518333
5楼2010-05-08 15:35:49
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zhy19850501

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-05-08 15:22:25:
你用的是蓝白筛选吗？如果是蓝白筛选，那么选的白斑就绝对不是空载，而是连接的片段太小，你没有看到而已，所以我有可能是质粒污染。但是污染也不可能没有阳性，那你没有阳性，很有可能还是连接的问题，没有连上是 ...

我用的是双酶切的胶回收产物，大小是800bp，没进行蓝白斑筛选，只涂了抗生素。
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6楼2010-05-08 15:47:24
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zhy19850501

引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2010-05-08 15:35:49:
要完全避免空载体，你就把载体双酶切做空连对照再做吧。载体自连没有长起来就可以了，如果长得很多，那你的酶切有问题。
双酶切有问题你就单酶切。

我不太明白你说的双酶切有问题是怎么回事？
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7楼2010-05-08 15:49:10
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★ ★
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lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-08 18:42:15
片段切好了就不会有问题 载体要好好切切
pET28a拷贝数很低 载体抽质粒时抽浓一些 切好一批量大的放着每次取个半微升以后省事
告诉我酶切位点
28a很大 5.5k克隆几百bp 会不会你鉴定的时候切下来的小片段太稀了没看见啊
倒个1.2%的胶 构建好以后抽浓点切 酶要过量 温育3h以上 跑胶再看
酶切鉴定 TAE就不用了 看不出什么来 直接抽提 kana用50就行 用普通的克隆菌 不要用BL21 等确定对了纯了再转BL21

你直接连接测序怎么办？ pET通用引物有的 但是中国很多公司给的不对 你在哪个城市 上海这边不行 我一般PCR产物测完了对了再连
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Bemühen Sie !
8楼2010-05-08 16:32:15
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zhy19850501

引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-05-08 16:32:15:
片段切好了就不会有问题 载体要好好切切
pET28a拷贝数很低 载体抽质粒时抽浓一些 切好一批量大的放着每次取个半微升以后省事
告诉我酶切位点
28a很大 5.5k克隆几百bp 会不会你鉴定的时候切下来的小片段太稀了没 ...

我的酶切位点是BamHI和HandIII,你是建议我把双酶切后的PET-28载体转化到克隆菌中吗，这怎么鉴定它的纯度？
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9楼2010-05-08 16:51:02
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lingn

木虫 (正式写手)
★ ★
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plantaqp(金币+1):欢迎交流 2010-05-09 03:20:41
把双酶切后的PET-28载体转化到感受态里，应该一个斑都长不出来。如果有斑长起来了，就说明酶切的不充分，或者感受态污染了。
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10楼2010-05-08 17:11:25
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