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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★
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plantaqp(金币+1):欢迎交流 2010-05-09 03:21:55
引用回帖:
Originally posted by lingn at 2010-05-08 17:11:25:
把双酶切后的PET-28载体转化到感受态里，应该一个斑都长不出来。如果有斑长起来了，就说明酶切的不充分，或者感受态污染了。

这就是我说过的空载体连接对照。我们做连接一般是要做载体的自连对照的。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
11楼2010-05-08 20:20:19
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我最近构建的pET28a也连不上，折腾了好久了。
原因不清楚。用的是NcoI和HindIII，另外一个用的是NdeI和EcoRI。
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12楼2010-05-08 21:36:05
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plantaqp

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by zhy19850501 at 2010-05-08 15:09:49:
我的目的片段浓度可能比较低，但不至于一点都连不上吧，我提的质粒确实是空载。

目的片段浓度越低效率越低，所以把目的片段浓度提高了在连接吧，否则费时费力有费神！
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13楼2010-05-09 03:50:14
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎回来多多交流~~ 2010-05-19 21:23:56
楼主 断开的质粒不是复制子 转进去没用的 新菌长不出来
是切好了 要么跑个胶对对大小回收了 要么直接沉淀(如果你比较有信心)
B/H 很好切的

楼上的版主意见可以参考一下 说注意比例 片断比载体一般是几倍比一的关系 具体加多少自己灵活控制 载体少为了防止总是拣到自连的点

双酶切不会自连 有自连的是没切干净的混进去的 转化是小概率事件的放大事件

还有什么问题再发上来
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Bemühen Sie !
14楼2010-05-13 08:42:49
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):感谢交流~~ 2010-05-19 21:24:18
另外5楼的同学所指的单酶切意思是叫你分步酶切 B/H不用分步也可以切开可以共用Buffer 我觉得你不是这个问题
你说的假阳性是指转进去空载体的意思吧 那应该是你载体没切好 然后连接时片断和载体比例不对

请版主大人照顾一下楼主 去掉自动奖励 他金币本来不多 以后没法提问题了

实在不行你这样 找一个克隆载体 先连上再说 然后重新切下来(这样片断就多了) 切一批 然后pET载体按上次我说的方法 克隆载体下来的片断和pET再连一次
多一步 连接一定要找手感 连上了以后总能连上
pET不是克隆载体但是可以用作分子克隆 其实图省事但是不方便
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Bemühen Sie !
15楼2010-05-13 08:51:12
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zhy19850501

引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-05-13 08:51:12:
另外5楼的同学所指的单酶切意思是叫你分步酶切 B/H不用分步也可以切开可以共用Buffer 我觉得你不是这个问题
你说的假阳性是指转进去空载体的意思吧 那应该是你载体没切好 然后连接时片断和载体比例不对

请版主 ...

呵呵，谢谢你的建议~~我会尝试的
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16楼2010-05-19 20:13:19
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1、我也是用B..I和 Hind III进行的，插入片段300bp，ok，并且还改掉了其抗性。
2、插入片段的mol数量比值，800bp左右的话，按照大约5-8：1于载体。
3、连接时，用的T4连接酶吗？可以16℃过夜。
4、因为6kb大小了，并此质粒拷贝度不高，提取质粒后，注意用量，酶切可用单切+单切+双切互为对照。
5、也可用片段两侧引物pcr检测
6、注意抗生素是否失效？添加浓度等。
祝福好运！
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17楼2010-05-19 21:28:16
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
7、转化感受态中，一般不是主要问题！
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18楼2010-05-19 21:29:19
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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by plantaqp at 2010-05-09 03:50:14:
目的片段浓度越低效率越低，所以把目的片段浓度提高了在连接吧，否则费时费力有费神！

请教一下，我连啦两个月了，用的PQE30载体，连，504bp的片段，感觉连上了，但是酶切验证时，载体片段偏小，测序目的序列正确。旁边的载体序列不对。《补充：用的酶切位点：SPHI,SALI》

同时我用这个载体ECORI，SPHI 连了一个467的片段，酶切验证片段的浓度总是很低，次序正确了，再用这个载体连504的片段，酶切验证：切得片段就是不对
我转化到啦表达宿主菌，是不是有问题啊
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寻找方向，前进
19楼2012-03-15 11:19:06
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plantaqp

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+1, Good! 2012-03-18 17:26:24
引用回帖:
1266108楼: Originally posted by junxiao0320 at 2012-03-15 11:19:06:
请教一下，我连啦两个月了，用的PQE30载体，连，504bp的片段，感觉连上了，但是酶切验证时，载体片段偏小，测序目的序列正确。旁边的载体序列不对。《补充：用的酶切位点：SPHI,SALI》

同时我用这个载体ECORI ...

测序目的片段正确 旁边载体序不对 是不是载体搞错了？？
一般没切一下大小差不多就好，为了保险起见就测序最可靠。最好每一步都做到很踏实，否则后面心里都不踏实，万一出差错，最后可能要付出很大的代价。
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20楼2012-03-18 06:23:43
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