【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因 - 分子生物 - 综合其他

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11楼2010-05-08 20:20:19

月月大可

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我最近构建的pET28a也连不上，折腾了好久了。
原因不清楚。用的是NcoI和HindIII，另外一个用的是NdeI和EcoRI。

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12楼2010-05-08 21:36:05

plantaqp

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引用回帖:

Originally posted by zhy19850501 at 2010-05-08 15:09:49:
我的目的片段浓度可能比较低，但不至于一点都连不上吧，我提的质粒确实是空载。

目的片段浓度越低效率越低，所以把目的片段浓度提高了在连接吧，否则费时费力有费神！

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13楼2010-05-09 03:50:14

chemifunan

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lstt09nk(金币+2):欢迎回来多多交流~~ 2010-05-19 21:23:56

楼主断开的质粒不是复制子转进去没用的新菌长不出来
是切好了要么跑个胶对对大小回收了要么直接沉淀(如果你比较有信心)
B/H 很好切的

楼上的版主意见可以参考一下说注意比例片断比载体一般是几倍比一的关系具体加多少自己灵活控制载体少为了防止总是拣到自连的点

双酶切不会自连有自连的是没切干净的混进去的转化是小概率事件的放大事件

还有什么问题再发上来

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14楼2010-05-13 08:42:49

chemifunan

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lstt09nk(金币+3):感谢交流~~ 2010-05-19 21:24:18

另外5楼的同学所指的单酶切意思是叫你分步酶切 B/H不用分步也可以切开可以共用Buffer 我觉得你不是这个问题
你说的假阳性是指转进去空载体的意思吧那应该是你载体没切好然后连接时片断和载体比例不对

请版主大人照顾一下楼主去掉自动奖励他金币本来不多以后没法提问题了

实在不行你这样找一个克隆载体先连上再说然后重新切下来(这样片断就多了) 切一批然后pET载体按上次我说的方法克隆载体下来的片断和pET再连一次
多一步连接一定要找手感连上了以后总能连上
pET不是克隆载体但是可以用作分子克隆其实图省事但是不方便

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15楼2010-05-13 08:51:12

zhy19850501

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引用回帖:

Originally posted by chemifunan at 2010-05-13 08:51:12:
另外5楼的同学所指的单酶切意思是叫你分步酶切 B/H不用分步也可以切开可以共用Buffer 我觉得你不是这个问题
你说的假阳性是指转进去空载体的意思吧那应该是你载体没切好然后连接时片断和载体比例不对

请版主 ...

呵呵，谢谢你的建议~~我会尝试的

16楼2010-05-19 20:13:19

zhwenxing

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1、我也是用B..I和 Hind III进行的，插入片段300bp，ok，并且还改掉了其抗性。
2、插入片段的mol数量比值，800bp左右的话，按照大约5-8：1于载体。
3、连接时，用的T4连接酶吗？可以16℃过夜。
4、因为6kb大小了，并此质粒拷贝度不高，提取质粒后，注意用量，酶切可用单切+单切+双切互为对照。
5、也可用片段两侧引物pcr检测
6、注意抗生素是否失效？添加浓度等。
祝福好运！

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17楼2010-05-19 21:28:16

zhwenxing

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7、转化感受态中，一般不是主要问题！

18楼2010-05-19 21:29:19

junxiao0320

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引用回帖:

13楼: Originally posted by plantaqp at 2010-05-09 03:50:14:
目的片段浓度越低效率越低，所以把目的片段浓度提高了在连接吧，否则费时费力有费神！

请教一下，我连啦两个月了，用的PQE30载体，连，504bp的片段，感觉连上了，但是酶切验证时，载体片段偏小，测序目的序列正确。旁边的载体序列不对。《补充：用的酶切位点：SPHI,SALI》

同时我用这个载体ECORI，SPHI 连了一个467的片段，酶切验证片段的浓度总是很低，次序正确了，再用这个载体连504的片段，酶切验证：切得片段就是不对
我转化到啦表达宿主菌，是不是有问题啊

寻找方向，前进

19楼2012-03-15 11:19:06

plantaqp

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西瓜: 金币+1, Good! 2012-03-18 17:26:24

引用回帖:

1266108楼: Originally posted by junxiao0320 at 2012-03-15 11:19:06:
请教一下，我连啦两个月了，用的PQE30载体，连，504bp的片段，感觉连上了，但是酶切验证时，载体片段偏小，测序目的序列正确。旁边的载体序列不对。《补充：用的酶切位点：SPHI,SALI》

同时我用这个载体ECORI ...

测序目的片段正确旁边载体序不对是不是载体搞错了？？
一般没切一下大小差不多就好，为了保险起见就测序最可靠。最好每一步都做到很踏实，否则后面心里都不踏实，万一出差错，最后可能要付出很大的代价。

20楼2012-03-18 06:23:43