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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
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zhy19850501

[交流] 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因 已有14人参与

大家好，我构建表达载体连接PET-28A，已经连接多次但都失败，感受态细胞也换了几次，鉴定全是假阳性，这可能是什么原因呢，希望大家多多帮忙！
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1楼 2010-05-08 14:27:43
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1、我也是用B..I和 Hind III进行的，插入片段300bp，ok，并且还改掉了其抗性。
2、插入片段的mol数量比值，800bp左右的话，按照大约5-8：1于载体。
3、连接时，用的T4连接酶吗？可以16℃过夜。
4、因为6kb大小了，并此质粒拷贝度不高，提取质粒后，注意用量，酶切可用单切+单切+双切互为对照。
5、也可用片段两侧引物pcr检测
6、注意抗生素是否失效？添加浓度等。
祝福好运！
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17楼2010-05-19 21:28:16
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
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1。提取过质粒吗，是空载体吗，会不会是某种酶没有切开啊，或者是片段或者是质粒。连接时片段的量一定要远高于载体的片段，至少片段：载体>3吧
2。感受态可能没有问题，毕竟有菌长起来，要是验证感受态的话，可以转点质粒看看。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-05-08 14:44:43
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zhy19850501

我的目的片段浓度可能比较低，但不至于一点都连不上吧，我提的质粒确实是空载。
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3楼2010-05-08 15:09:49
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-08 18:50:34
你用的是蓝白筛选吗？如果是蓝白筛选，那么选的白斑就绝对不是空载，而是连接的片段太小，你没有看到而已，所以我有可能是质粒污染。但是污染也不可能没有阳性，那你没有阳性，很有可能还是连接的问题，没有连上是最大的原因。你连接的片段是PCR产物，还是胶回收产物，还是其他什么片段，浓度怎么样，长度多大
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4楼2010-05-08 15:22:25
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