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zhy19850501

[交流] 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因 已有14人参与

大家好,我构建表达载体连接PET-28A,已经连接多次但都失败,感受态细胞也换了几次,鉴定全是假阳性,这可能是什么原因呢,希望大家多多帮忙!
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-08 18:50:34
你用的是蓝白筛选吗?如果是蓝白筛选,那么选的白斑就绝对不是空载,而是连接的片段太小,你没有看到而已,所以我有可能是质粒污染。但是污染也不可能没有阳性,那你没有阳性,很有可能还是连接的问题,没有连上是最大的原因。你连接的片段是PCR产物,还是胶回收产物,还是其他什么片段,浓度怎么样,长度多大
4楼2010-05-08 15:22:25
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1。提取过质粒吗,是空载体吗,会不会是某种酶没有切开啊,或者是片段或者是质粒。连接时片段的量一定要远高于载体的片段,至少片段:载体>3吧
2。感受态可能没有问题,毕竟有菌长起来,要是验证感受态的话,可以转点质粒看看。。。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-05-08 14:44:43
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zhy19850501

我的目的片段浓度可能比较低,但不至于一点都连不上吧,我提的质粒确实是空载。
3楼2010-05-08 15:09:49
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
要完全避免空载体,你就把载体双酶切做空连对照再做吧。载体自连没有长起来就可以了,如果长得很多,那你的酶切有问题。
双酶切有问题你就单酶切。
生物资源交流QQ群:1044518333
5楼2010-05-08 15:35:49
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